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Notch1/NRG1通路在熊果苷抑制心肌细胞凋亡、减轻心肌纤维化中的作用机制研究

2022-10-10武菲菲徐臣年翟蒙恩

解放军医药杂志 2022年7期
关键词:胶原心肌细胞纤维化

武菲菲,徐臣年,金 屏,翟蒙恩,乔 锐,郭 红

心肌纤维化(MF)是常见的心血管病理生理表现,具体机制尚不明确,研究认为MF可能成为多种疾病治疗的有效靶点[1-4]。研究表明,Notch信号通路是机体生长发育的关键分子,其介导的相关凋亡及自噬与MF、心肌损伤关系密切[5-7]。目前MF治疗尚缺乏有效策略,中药提取物熊果苷(AR)具有较强的抗氧化应激、抗炎作用,可通过不同机制修复组织损伤[8-11]。本研究采用异丙肾上腺素(ISO)诱导MF小鼠模型,探讨AR对MF的改善作用及对Notch1/NRG1信号通路的调控作用。

1 材料与方法

1.1实验动物及试剂 实验动物选择6周龄健康雄性C57/BL小鼠80只,体质量(20.12±1.45)g,购自空军军医大学实验动物中心,实验动物许可证号:SYXK(陕)2019-001。Fas、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Notch1、NRG1、GAPDH抗体、AR购于美国Sigma公司;ISO购于天津泰泽兴业生物科技有限公司。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、结缔组织生长因子(CTGF)试剂盒购于美国R&D Systems公司。

1.2研究方法

1.2.1分组及模型建立:80只小鼠按随机数字表法分为对照组(Sham组)、心肌纤维化组(MF组)、AR处理组(AR+MF组)和AR联合Notch1抑制剂(DAPT)处理MF组(AR+DAPT+MF组),每组20只。MF组、AR+MF组、AR+DAPT+MF组于小鼠肩胛间皮下注射ISO(7 mg/kg、3/d),重复给药持续15 d,Sham组于同一部位注射相同体积生理盐水。AR+MF组腹腔注射AR 10 mg/(kg·d),AR+DAPT+MF组腹腔注射AR 10 mg/(kg·d)及DAPT 10 mg/(kg·d),重复给药持续15 d。

1.2.2ELISA法检测小鼠血清TNF-α、CTGF水平:各组小鼠经2%异氟烷麻醉后,固定,剪开并剥离小鼠颈部皮肤、皮下组织,暴露颈动脉,以组织剪剪开快速取血2 ml至EP管中,3000 r/min离心15 min,取上层血清。按照TNF-α、CTGF检测试剂盒说明书检测。

1.2.3心脏超声检测小鼠心功能:各组小鼠经2%异氟烷麻醉后四肢固定超声仪电极,探头在乳头肌水平位置用M型取样线检测,测量并计算左心室射血分数(LVEF)、左心室短轴缩短率(LVFS)、左心室舒张末期前壁厚度(LVAWd)。

1.2.4天狼猩红、Masson染色检测小鼠心肌组织纤维化程度:达实验终点后,各组小鼠经2%异氟烷麻醉后迅速剪下心脏,冷PBS液冲洗3遍,以多聚甲醛(40 g/L)固定72 h,石蜡包埋、切片,行天狼猩红、Masson染色,在光学显微镜下拍摄天狼猩红、Masson染色后图像并保存。

1.2.5qPCR检测小鼠心肌组织Fas、Caspase-3 mRNA表达量:用Trizol试剂从组织中分离总RNA,逆转录生成cDNA,用BIO-RAD分光光度法测定RNA和cDNA浓度和纯度,Primer Premier 6.0软件设计引物并合成。在iQTM5 RT-PCR系统中行PCR扩增,采用2-ΔΔCt法测定Fas、Caspase-3 mRNA表达量。

1.2.6TUNEL染色检测小鼠心肌凋亡水平:按TUNEL试剂盒说明书将各组小鼠心肌组织石蜡切片染色,荧光显微镜下拍照,每张切片随机选取10个高倍视野观察。染色每个阳性点作为一个细胞计数,与之重叠的绿点计数为凋亡细胞,凋亡细胞数除以总细胞数得出凋亡指数。

1.2.7Western blot法检测凋亡相关蛋白表达:各组小鼠取相同质量心肌组织放入离心管中,加入预冷PBS液,剪碎心肌组织,4 ℃ 3000×g离心10 min,弃上清,沉淀中加入含蛋白酶抑制剂的RIPA强裂解液,冰上充分研磨并裂解30 min,4 ℃ 12 000×g离心30 min,取上清。电泳并用湿转法将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜,5%脱脂奶粉室温下封闭2 h,裁剪目的条带,放入对应Notch1(1∶1000)、NRG1(1∶1000)、Fas(1∶1000)、Bcl-2(1︰1000)、Bax(1︰1000)、Caspase-3(1︰1000)和GAPDH抗体(1︰5000)中,4 ℃摇床孵育过夜;TBST洗脱3次,每次5 min,将目的条带放入山羊抗兔或抗鼠二抗(1︰5000)中室温摇床孵育2 h,TBST洗脱3次,每次5 min,ECL化学发光液避光检测统计灰度值。

2 结果

2.1DAPT能阻断AR改善MF所致心功能障碍及心肌损伤 与Sham组比较,MF组心功能明显降低,LVEF、LVFS显著减小,LVAWd明显增大(P<0.05);与MF组比较,AR+MF组LVAWd明显减小,LVEF、LVFS明显增加(P<0.05);与AR+MF组比较,AR+DAPT+MF组LVEF、LVFS及LVAWd明显降低或减小(P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠心功能心脏超声检测结果比较

与Sham组比较,MF组血清TNF-α、CTGF水平及心肌组织Fas、Caspase-3 mRNA表达明显增加(P<0.05);与MF组比较,AR+MF组血清TNF-α、CTGF水平及心肌组织Fas、Caspase-3 mRNA表达明显降低或减少(P<0.05);与AR+MF组比较,AR+DAPT+MF组血清TNF-α、CTGF水平及心肌组织Fas、Caspase-3 mRNA表达明显增加(P<0.05)。见表2。

表2 各组小鼠血清TNF-α、CTGF及心肌组织Fas、Caspase-3 mRNA相对表达量比较

2.2DAPT可阻断AR改善MF心肌结构和纤维化 Sham组小鼠心肌组织纤维排列整齐,无纤维化,胶原含量低;MF组可见细胞核多逸出,心肌结构排列紊乱,肌纤维断裂明显,胶原含量高;与MF组相比,AR+MF组肌纤维排列整齐,纤维化程度改善,胶原含量降低;与AR+MF组相比,AR+DAPT+MF组心肌纤维化程度明显增加,排列紊乱,胶原含量增高。见图1。

图1 各组小鼠心肌组织纤维化程度天狼猩红、Masson染色结果(×400)

2.3AR能抑制MF所致心肌细胞凋亡及DAPT阻断AR的作用 心肌组织TUNEL染色结果表明,与Sham组比较,MF组心肌组织TUNEL阳性染色数量明显增加;与MF组比较,AR+MF组TUNEL阳性染色数量明显减少;与AR+MF组比较,AR+DAPT+MF组TUNEL阳性染色数量显著增加。见图2。

图2 各组小鼠心肌细胞凋亡情况

Western blot法检测结果显示,与Sham组比较,MF组心肌组织中Notch1、NRG1、Bcl-2表达量明显降低,Fas、Caspase-3、Bax表达量增加(P<0.05);与MF组比较,AR+MF组心肌组织Notch1、NRG1、Bcl-2表达量明显升高,Fas、Caspase-3、Bax表达量降低(P<0.05);与AR+MF组比较,AR+DAPT+MF组心肌组织Notch1、NRG1、Bcl-2表达量降低,Fas、Caspase-3、Bax表达量增加(P<0.05)。见表3。

表3 各组小鼠心肌组织凋亡相关蛋白表达量比较

3 讨论

MF是由多种因素引起的,这些因素可导致胶原纤维过度沉积,胶原浓度显著增强,心肌胶原类型和结构排列紊乱[12-14]。研究表明,MF、心血管疾病及环境之间存在着密切而复杂的关系[15-17]。MF是心肌重构的主要病理基础,也是心律失常、心力衰竭等心血管事件的潜在危险因素[18-20]。研究表明,肾素-血管紧张素-醛固酮系统、趋化因子、内皮素-1和血小板衍生生长因子与MF密切相关[21]。然而近年研究表明凋亡、自噬在MF中起着重要作用[22-23]。然而凋亡、自噬与MF的作用机制尚不十分清楚,凋亡与自噬的调节可能成为治疗MF的潜在目标。

本研究结果发现,MF与Notch1/NRG1通路介导的细胞凋亡有关,同时AR可激活Notch1/NRG1通路抑制细胞凋亡。结果一定程度阐明了MF的作用机制,并可能辅助探寻预防和治疗MF的靶点。Notch信号与血管发育、内环境稳定和炎症反应相关[24]。Notch通路在细胞凋亡过程中调节细胞自我更新、组织生长发育[25-26]。Notch1信号传导的下游基因包括NRG1和HRT,Notch1激活抑制心肌细胞凋亡,Notch1/NRG1通路在心血管系统细胞增殖、修复中起关键作用。Notch1和NRG1已证明能通过多种途径抑制细胞凋亡、促进细胞存活以保护心脏结构和功能[24]。Notch1直接靶向NRG1,AR可能通过激活NRG1在MF模型中发挥保护作用。AR本身具有抗氧化、抗凋亡等作用,然而AR对ISO所致心肌细胞凋亡的调控作用有待进一步研究。本实验结果表明,在MF模型中,Notch1和NRG1表达均下调,而AR组Notch1和NRG1表达恢复。DAPT是Notch1抑制剂,可通过阻断Notch1减弱AR对MF的改善作用。故通过抑制Notch1/NRG1通路,部分消除AR对ISO所致MF心肌组织的保护作用。DAPT还可部分消除AR通过Notch1/NRG1通路对心肌细胞凋亡的影响。总的来说,AR可通过激活Notch1/NRG1通路发挥心肌保护作用。

尽管如此,凋亡在MF及不同疾病不同发病阶段的具体作用机制尚不清楚,凋亡、MF及二者间的关系仍需深入研究与探索。本研究阐明了AR对ISO所致MF心肌细胞凋亡的保护机制,发现MF与Notch1/NRG1通路介导的心肌细胞凋亡有关,同时AR激活Notch1/NRG1通路可抑制细胞凋亡。

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