冯秋琴 黄 欢 陈宏君 田 曼

1.广东省珠海市妇幼保健院小儿呼吸科，广东珠海 519000；

2.广东省珠海市妇幼保健院儿童脑发育与康复科，广东珠海 519000；

3.南京医科大学附属儿童医院呼吸科，江苏南京 210008

毛细支气管炎是一种下呼吸道感染性疾病，具有潜在危及生命的危险，主要感染婴幼儿，并在几天内出现咳嗽，呼吸过度，喘息等临床表现[1]。在这些患儿中，住院患呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）感染的毛细支气管炎婴儿中有3%～10%出现呼吸衰竭[2]。另外，外周血单个核 细 胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）在很多炎症反应过程中发挥重要作用。有研究发现慢性阻塞性肺疾病中红霉素的治疗依赖单个核细胞的参与作用，红霉素可以增加单个核细胞HDAC的活性，并减少NF-kB转录活性及IL-8的合成[3]。蛋白质乙酰化，是一种重要的表观遗传修饰模式，在宿主防御病毒感染中起着关键作用。组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases，HDACs）则是通过调控蛋白质稳定性、蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质-脱氧核糖核酸，进而调控细胞功能[4-5]。组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylasesinhibitor，HDACi）目前在临床应用广泛。如曲古抑制素A（trichostatin A，TSA），因其作为抗癌药物的潜在用途而受到关注。除了具有抗癌活性之外，还表现出有效的抗炎特性，其治疗效果已在感染性休克、类风湿性关节炎和哮喘中得到证实[6-7]。另外，TSA被发现可降低丙型肝炎病毒的复制[8]。本研究旨在从动物水平探讨HDACi[代表药物TSA及辛二酰苯胺异羟肟酸（SAHA）]对RSV毛细支气管炎小鼠血液PBMC细胞培养上清液中炎症因子、氧化应激因子的表达影响。TSA、SAHA可能是调节RSV诱导的毛细支气管炎的一种新的治疗方法，为临床新治疗手段提供基础研究依据。

1 材料与方法

1.1 材料

选择40只8～10周龄的雌性BALB/c小鼠（购自南京大学动物研究中心）；药品TSA、SAHA均 购 自Sigma-Aldrich（St.Louis，MO，USA，批 号T20190006/S202103154）；细胞培养需要的DMEM培养基和胎牛血清购自Carlsbad，CA，USA；丙二醛（MDA），一氧化氮（NO）检测试剂盒购自Jiancheng Bioengineering Institute批号CAS542-78-9/CAS15917-77-8；白 介 素-6（IL-6）、肿 瘤 坏 死 因 子-α（TNF-α）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购自上海Ex Cell Biology Inc，批号CAS148157-34-0/CAS94948-59-1。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立 本实验已通过我院伦理委员会审核。40只8～10周龄的雌性BALB/c小鼠，先在无特定病原体的条件下饲养，温度（25±1）℃；湿度60%；12 h光照周期，给予标准的啮齿动物饲料，自由饮水。采用随机数表法将40只小鼠分为四组：正常对照组10只、RSV处理组10只、TSA+RSV处理组10只、SAHA+RSV处理组10只。所有动物研究均按照NIH指南进行[12]，在异氟烷轻度麻醉下，用PBS注射入对照组10只小鼠鼻内，再向处理组30只小鼠鼻内接种RSV病毒（5×105 PFU），处理组每组10只小鼠共30只，通过离体噬斑测定确认RSV感染。TSA+RSV处理组、SAHA+RSV处理组在RSV注射后的当天、注射后第1天和注射后第2天，将TSA[0.5 mg/（kg·d）]和SAHA[25 mg/（kg·d）]1 ml腹腔内注射3 d，药物满3 d后处死小鼠，对照组10只小鼠这3 d腹腔注射生理盐水1 ml作对照处理。

1.2.2 应用Q-PCR测定HDACi对RSV病毒复制的影响 四组动物均在药物处理3 d后处死小鼠，提取小鼠肺组织，通过测量RSV-病毒载量，使用RT-qPCR定量肺组织中RSV-L基因表达的水平。

1.2.3 PBMC的获取 四组均在药物处理3 d后处死小鼠，提取小鼠肺泡灌洗液2 ml，同时取肺组织备用。血液取后应用肝素抗凝，与等量PBS混匀。在离心管中加入适量淋巴细胞分离液（使用前需恢复至室温，淋巴细胞分离液与血样1∶1）。用滴管将血样沿管壁缓慢叠加于分层液面上，保持清楚的界面。室温水平离心后管内分为3层，在上、中层界面处有一个以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，用吸管直接吸取，并重复洗涤2次，得到外周血PBMC。

1.2.4 PBMC的培养 将获得的四组小鼠的外周血PBMC以含100 ml/L胎牛血清的RPMI1640培养液重悬至1×106个/ml，培养于24孔板中，每孔1 ml，加入植物血凝素，终浓度为50 mg/L，细胞培养24 h后留取细胞培养液，留待测定上清液中炎症因子和氧化应激分子表达水平。

1.2.5 酶联免疫ELISA检测炎症因子、氧化应激因子水平 体外培养四组PBMC细胞，24 h后留取上清液，通过ELISA测量促炎细胞因子IL-6和TNF-α的水平；测定氧化应激相关分子MDA和NO的水平。

1.2.6 组织病理学分析 四组动物药物处理3 d后，处死小鼠，用2×0.5 ml等份预冷的PBS灌注肺部，随后将肺组织固定在10%福尔马林溶液中并包埋在石蜡中，在载玻片上切割石蜡切片（4 μm），用标准方案进行苏木精和伊红（HE）染色。在光学显微镜下观察病理损伤的程度。

2 结果

2.1 HDACi药物TSA、SAHA可以抑制RSV复制

使用PCR技术检测肺部RSV病毒载量，将RSV感染的小鼠暴露于HDACi药物TSA、SAHA后病毒载量下降，差异有统计学意义（P< 0.05）。见表1。

表1 各组RSV病毒载量比较（copies/ml）

2.2 TSA、SAHA可以抑制RSV诱导的毛细支气管炎小鼠模型中PBMC炎性细胞因子和氧化应激因子的释放

为确定HDAC抑制剂是否影响RSV诱导的气道炎症，使用ELISA测量PBMC细胞上清液中促炎细胞因子的产生，结果显示TSA或SAHA处理抑制IL-6和TNF-α的释放，差异有统计学意义（P< 0.05）。见表2。另外，氧化应激相关因子NO水平有下降趋势；MDA的水平在药物处理后也明显下降，差异有统计学意义（P< 0.05）。见表3。

表2 各组促炎细胞因子IL-6、TNF-α释放水平比较（pg/ml，x ± s）

表3 各组氧化应激相关分子NO、MDA释放水平比较（x ± s）

2.3 组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA、SAHA可以减轻RSV病毒引起的肺损伤

光学显微镜下观察四组小鼠肺部病理损伤的程度，结果显示RSV处理组炎症浸润情况明显高于对照组，表现为支气管周围、血管周围及肺泡中明显的炎症细胞浸润，TSA+RSV处理组及SAHA+RSV处理组肺部炎症浸润情况较RSV组明显减轻，其中SAHA+RSV组炎症抑制作用表现得更明显（图1）。提示HDACi在RSV感染肺部中起到明显的抗炎作用。

图1 四组小鼠肺组织HE染色评估气道炎症的严重程度和肺损伤的情况比较

3 讨论

目前对于RSV的病理机制研究有很多，但尚不明确，其中一个关键点是RSV感染后出现不同临床症状的个体，有些人只有轻微的感冒症状，不需要特殊治疗，而在另一些人中，RSV感染可能导致严重的疾病，包括毛细支气管炎或肺炎，严重时甚至威胁生命[9]。

组蛋白去乙酰化酶HDACs在基因表达调控中起着至关重要的作用，它通过乙酰化和去乙酰化组蛋白来调节染色质结构，有研究证实组蛋白乙酰化控制某些病毒的感染[10]。在感染人类的诸多病原体中，HDACs与病毒复制和发病有关，包括疱疹病毒、人乳头瘤病毒、柯萨奇病毒、乙型丙型肝炎、HCV和人类免疫缺陷病毒HIV-1[11]。如在丙肝病毒感染期间，HDACi类药物SAHA通过改变宿主细胞中基因（如OPN和Apo-A1）的表达而对HCV复制发挥抑制作用。本研究探究组蛋白乙酰化是否在RSV复制和病毒诱导的气道炎症的调节中起作用。

有研究发现，HDACs中HDAC2的异常表达在肺部参与介导了严重哮喘或慢性阻塞性肺疾病患者的甾体抗性作用[12]，但具体参与机制尚未研究。另外，外周血单个核细胞已证实在很多炎症反应过程中发挥重要作用，基于这些研究基础，本研究提示，用HDACi处理RSV感染的小鼠，RSV病毒的复制被抑制。

HDACi在体外和体内均发挥抗炎作用。HDACi类药物TSA可减轻过敏性哮喘小鼠模型中的炎症[13]，使用HDACi减轻了脂多糖诱导的急性小鼠肺损伤[14]。本研究表明，使用TSA、SAHA可显著减轻RSV诱导的促炎细胞因子的产生IL-6和TNF-α的释放，IL-6和TNF-α的表达降低可以解释HDACis处理后毛细支气管炎小鼠模型中中性粒细胞和T细胞浸润的减少。

另外，氧化应激相关因子参与多种形式的组织损伤，包括对脂质、蛋白质和DNA等细胞成分的损害[15]。在本研究中，RSV感染的小鼠的肺中NO，MDA显著增加，而HDACi逆转了这一过程。

总之，本研究探讨了HDACi在抑制RSV感染、调节病毒诱导的气道炎症中的功能和参与的相关机制。未来需进行药物临床试验，进一步明确和验证去乙酰化酶抑制剂HDACi在RSV诱导的患者气道炎症中的作用情况和参与的相关机制，为HDACi类药物将来进入临床治疗呼吸道疾病提供重要的数据支持。