赵红丹,郭康,宋士军,高明

(1 新乡医学院第三附属医院肿瘤内二科，河南 新乡 453000； 2 郑州大学第一附属医院肿瘤科)

食管癌作为世界常见六大恶性肿瘤之一，具有显著的地域分布差异[1-2]。我国是食管癌高病死率国家，其中90%以上为鳞状细胞癌[3-4]。食管癌的发病与饮食习惯、生活环境、遗传因素、种族差异、地理分布等均有密切关系[5-7]。食管癌的发病过程涉及基因的遗传学改变，包括原癌基因的激活和抑癌基因的失活[8-10]。SMAD4最早以胰腺癌的抑癌基因被发现，后续研究证实其表达缺失与人类多种恶性肿瘤的进程相关[11]。同时，微小RNAs(miRNA)作为一种非编码的内源性单链小分子RNA，已经被证实可以通过靶向调节mRNA的降解或抑制该类靶基因的翻译，进而激活或抑制下游信号通路，参与并介导肿瘤细胞的生长、增殖和凋亡等行为[12-13]。鉴于此，本研究通过探究miR-145-5p是否可以通过靶向调控SMAD4基因介导TGF-β/Smad4信号通路，进而参与食管鳞状细胞癌细胞增殖和凋亡，并阐述其关联作用机制，以期为食管鳞状细胞癌的早期诊疗和预后评估提供新的分子标志物。

1 资料和方法

1.1 实验材料

1.1.1组织标本 收集新乡医学院第三附属医院2016年3月—2019年3月经病理确诊的食管鳞状细胞癌病人68例，男40例，女28例，年龄34～78岁，平均(57.48±6.88)岁。所有病例均未接受放化疗；既往无除食管鳞状细胞癌之外的恶性肿瘤病史；既往无糖尿病、高血压及严重心脏病等病史；无家族遗传性病史。取食管鳞状细胞癌组织为实验组，同时取相应癌旁正常组织作为对照组。采集标本分为两份，一份液氮保存，一份甲醛固定备用。本研究通过医院伦理委员会评审批准，所有受试者均签署知情同意书。

1.1.2主要试剂与仪器 食管鳞状细胞癌细胞株TE-1、TE-13、ECA-109和TTN(购买于中国科学院上海细胞库)，目的质粒均购自上海生工生物工程技术服务有限公司(上海，中国)，Lipofectamin 2000试剂盒、RNA提取试剂盒(Invitrogen公司，USA)，Prime Script RT试剂盒(宝日医生物科技公司，北京)，PCR试剂盒(北京天根生化科技有限公司)，GAPDH(abcam公司，英国)，ECL试剂盒(Bio-Rad，美国)，CCK8试剂、Annexin-V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(碧云天生物技术公司，上海)；成像分析仪(Image Reader，Bio-Rad，美国)，酶标仪(赛默飞世尔科技有限公司，美国)。

1.2 实验方法

1.2.1免疫组化检测SMAD4阳性率 组织标本常规脱水、石蜡包埋，制作4 μm连续切片。参照试剂盒说明进行检测，其中，采用体积分数0.03的H2O2阻断内源性过氧化物酶活性，滴加非免疫山羊血清封闭；滴加鼠抗人SMAD4(1∶100)4 ℃冰箱内孵育过夜。次日复温后，加入生物素标记的山羊抗兔二抗IgG，37 ℃孵育30 min。应用含体积分数0.01 Tween20的PBS洗涤后，滴加辣根过氧化物酶-链霉卵白素复合物进行反应。每张切片随机选取5个视野(200倍)分别计数其阳性细胞，并取平均值。判定标准：阳性细胞≤10%为1分，11%～50%为2分，51%～80%为3分，≥81%为4分。

1.2.2食管鳞状细胞癌细胞株筛选 选择食管鳞状细胞癌细胞株TE-1、TE-13、ECA-109和TTN，将以上4种细胞株置培养液中培养，每24 h更换培养液，进行传代培养，并采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)方法筛选出miR-145-5p表达水平最低的细胞系用于后续实验。

1.2.3细胞分组与转染 选择培养的人食管鳞状细胞癌ECA-109细胞，将其分为6组：Blank组(不进行任何处理，a组)、NC组(转染阴性质粒，b组)、miR-145-5p mimic组(转染miR-145-5p mimic质粒，c组)、miR-145-5p inhibitor组(转染miR-145-5p inhibitor质粒，d组)、siRNA-SMAD4组(转染SMAD4siRNA质粒，e组)和miR-145-5p inhibi-tor+siRNA-SMAD4组(共转染siRNA-SMAD4质粒和miR-145-5p mimic质粒，f组)。将筛选细胞以每孔3×105个的密度接种于6孔板中，待细胞融合度达80%时，使用Lipofectamin 2000试剂盒进行转染。用250 μL无血清Opti-MEM培养液分别稀释目的质粒和Lipofectamine 2000。室温下静置5 min，两者混合均匀，放置20 min后将混合液加到培养孔中，置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2培养箱中培养，6 h后将培养液更换成完全培养液，继续培养48 h后，收集细胞。

1.2.4双荧光素酶报告实验 登录生物学预测网站(http://www.microrna.org和http://www.targetscan.org/vert_72/)进行miR-145-5p的靶基因预测，验证SMAD4是miR-145-5p的直接靶点。人工合成SMAD4基因3′UTR野生型(WT)和突变型(MUT)序列。构建荧光素酶报告载体，将测序正确的荧光素酶报告质粒WT、MUT分别与miR-145-5p mimic和miR-145-5p NC共转染至食管鳞状细胞癌细胞中。转染48 h后收集并裂解细胞，分别使用荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶活性。

1.2.5qRT-PCR检测各组相关基因的mRNA表达 取新鲜组织样本采用RNA提取试剂盒提取总RNA，使用Prime Script RT试剂盒将RNA逆转录成cDNA，逆转录体系11.5 μL。设计miR-145-5p、SMAD4、TGF-β、Bcl-2、Bax、U6和GAPDH引物，交由TAKARA公司合成。按照PCR试剂盒操作步骤进行qRT-PCR反应，反应条件为：95 ℃预变性5 min后，95 ℃、 40 s，57 ℃、40 s，72 ℃、40 s，循环40次，72 ℃延伸10 min，4 ℃、5 min。miR-145-5p的相对水平以U6为内参照，SMAD4、TGF-β、Bcl-2和Bax相对表达水平以GAPDH基因作为内参照。采用2-△△Ct法计算目的基因 mRNA的相对转录水平。该实验步骤同样适用于细胞实验。

1.2.6Western Blot检测各组相关基因的蛋白表达

收集转染48 h后各组细胞，以预冷PBS洗涤细胞3次，加入全蛋白裂解液后置冰上裂解30 min，收获蛋白。BCA法定量抽提蛋白后，于80 V泳道进行SDS-PAGE，待样品跑至分离胶时改用120 V电压继续电泳。电泳结束后，将蛋白转移至NC膜；置入50 g/L 脱脂奶粉溶液中室温孵育60 min。TBST洗膜3次后，加入一抗多克隆抗体SMAD4、TGF-β、Bcl-2、Bax和GAPDH于4 ℃过夜；TBST洗膜3次后，加入二抗(辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG)室温下孵育60 min。TBST洗膜3次后用ECL试剂盒进行发光反应，滤纸吸去膜表面多余底物溶液，置于成像分析仪中显影成像。用Quantity One软件分析条带灰度值，计算目的基因蛋白的相对表达量。每组3个样本，设3个平行孔，实验重复3次。

1.2.7CCK8法检测各组细胞增殖能力的变化情况

将转染12 h后的各组细胞铺入96孔培养板，调整细胞密度为2×106/L，每孔加入100 μL细胞培养液。将培养板置于室温下培养，分别检测24、48、72、96 h的细胞活力。每孔加10 μL的CCK8试剂，37 ℃孵育2 h，采用酶标仪检测450 nm波长处的光密度值(OD)。以时间点为横坐标，OD值为纵坐标绘制细胞活力曲线图。每组3个样本，设3个平行孔，实验重复3次。

1.2.8流式细胞仪检测各组细胞的周期和凋亡率

按照Annexin-V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明检测细胞凋亡。取各组转染48 h后的细胞，每100 μL染液重悬1×106个细胞，振荡混匀，加入5 μL的 Annexin-V-FITC溶液，振荡混匀。在室温下孵育15 min后，加入5 μL的 PI后轻轻混匀，于4 ℃下避光孵育5 min。在1 h内上流式细胞仪检测，在激发波长488 nm下检测细胞凋亡率。每组3个样本，设3个平行孔，实验重复3次。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 不同组织SMAD4蛋白及miR-145-5p mRNA表达比较

免疫组化检测显示，在食管癌组织中SMAD4蛋白阳性表达呈黄色或棕黄色颗粒，主要分布于细胞浆或细胞核。SMAD4蛋白在食管癌组织(44/68)中表达显著高于在正常癌旁组织(22/68)中表达，差异有显著性(χ2=14.251，P<0.05)。见图1A、B。qRT-PCR检测显示，与正常癌旁组织相比，食管癌组织中miR-145-5p的表达水平明显下降，差异有显著性(t=109.800，P<0.05)。见图1C。

A：正常癌旁组织与食管癌组织SMAD4蛋白表达；B：两组SMAD4蛋白阳性率比较；C：两组miR-145-5p表达比较。与正常癌旁组织比较，*P<0.05。

2.2 双荧光素酶报告基因实验

生物学的预测网站microRNA.org显示，miR-145-5p和SMAD4基因间存在结合位点(图2A)。双荧光素酶报告基因系统结果显示，与对照组相比，miR-145-5p mimic和SMAD4-wild共转染组荧光素酶荧光信号明显下降(t=21.820，P<0.05)，而SMAD4-mutant组荧光素酶信号无明显变化(t=0.775，P>0.05)。提示miR-145-5p能够特异性靶向结合SMAD4基因(图2B)。

A：miR-145-5p和SMAD4的结合位点；B：两组荧光素酶荧光信号比较。与对照组比较，*P<0.05。

2.3 食管鳞状细胞癌细胞株筛选

qRT-PCR检测食管鳞状细胞癌细胞株TE-1、TE-13、ECA-109和TTN中miR-145-5p表达量显示，与其他3种细胞株相比较，ECA-109细胞中的miR-145-5p表达量最低(F=48.000，P<0.05)。筛选出ECA-109细胞株用于后续实验。见图3。

与其他3种细胞株相比，*P<0.05。

2.4 各组细胞中相关基因mRNA和蛋白表达比较

qRT-PCR和Western Blot的检测结果显示，Blank组和NC组各基因mRNA和蛋白表达比较均无明显差异(F=2.023、0.557，P均>0.05)。与Blank组和NC组细胞比较，miR-145-5p mimic组miR-145-5p和Bax的mRNA和蛋白相对表达量增加(F=38.240～118.600，P均<0.05)，SMAD4、TGF-β和Bcl-2的mRNA和蛋白相对表达量显著降低(F=24.820～156.200，P均<0.05)；siRNA-SMAD4组miR-145-5p的表达无明显变化(F=0.937，P>0.05)，Bax的mRNA和蛋白相对表达水平显著增加(F=38.27、148.200，P均<0.05)，SMAD4、TGF-β和Bcl-2的mRNA和蛋白相对表达量降低(F=27.470～134.900，P均<0.05)；miR-145-5p inhibitor组miR-145-5p以及Bax的mRNA和蛋白相对表达量明显降低(F=65.550～82.320，P均<0.05)，SMAD4、TGF-β和Bcl-2的mRNA和蛋白相对表达水平上升(F=35.350～101.400，P均<0.05)。而miR-145-5p inhibitor+siRNA-SMAD4组与Blank组和NC组相比较差异均无显著性(P均>0.05)；且与siRNA-SMAD4组相比，miR-145-5p inhibitor+siRNA-SMAD4组SMAD4、TGF-β和Bcl-2的mRNA和蛋白相对表达量上升(t=15.920～24.020，P均<0.05)，miR-145-5p和Bax的mRNA和蛋白相对表达量降低(t=6.325～14.720，P均<0.05)。见图4A、B。

2.5 CCK8法检测各组细胞增殖活力

CCK8检测结果显示，在转染24 h各组细胞增殖能力均无明显差异，且NC组和Blank组相比各时间点细胞活力均无明显差异(P均>0.05)；在48、72和96 h时，与Blank组和NC组相比，miR-145-5p mimic组与siRNA-SMAD4组细胞活力均显著下降(F=10.770～22.340，P均<0.05)；miR-145-5p inhibitor组细胞活力显著升高(F=5.814～15.810，P<0.05)；miR-145-5p inhibitor+siRNA-SMAD4组与siRNA-SMAD4组比较细胞活力显著增加(P均<0.05)，而与NC组和Blank组相比无明显差异(P>0.05)。见图5。

a：Blank组，b：NC组，c：miR-145-5p mimic组，d：miR-145-5p inhibitor组，e：siRNA-SMAD4组，f：miR-145-5p inhibitor+siRNA-SMAD4组。与Blank组和NC组相比，*P<0.05；与miR-145-5p mimic组相比，#P<0.05。

2.6 流式细胞术检测各组细胞凋亡率

细胞凋亡实验的结果表明，转染后NC组与Blank组相比凋亡率无明显差异(t=0.537，P>0.05)；与Blank组和NC组相比，miR-145-5p mimic组与siRNA-SMAD4组细胞凋亡率显著升高(F=136.900、151.000，P均<0.05)；miR-145-5p inhibitor组凋亡率显著降低(F=18.000，P<0.05)；而miR-145-5p inhibitor+siRNA-SMAD4组的细胞凋亡率与siRNA-SMAD4组相比较明显降低(P<0.05)，与NC组和Blank组相比无明显差异(F=1.355，P>0.05)。见图6。

A：细胞转染后各组细胞凋亡率的流式细胞术检测；B：细胞转染后各组细胞凋亡率比较。a：Blank组，b：NC组，c：miR-145-5p mimic组，d：miR-145-5p inhibitor组，e：siRNA-SMAD4组，f：miR-145-5p inhibitor+siRNA-SMAD4组。与Blank组和NC组相比，*P<0.05；与miR-145-5p mimic组相比，#P<0.05。

3 讨 论

食管癌的病因及发病机制目前尚不明确。我国食管癌发病率高，其5年生存率低、预后不良[14]。作为食管癌的主要病理类型，食管鳞状细胞癌的诊治方案研发日益受到重视[15-16]。本研究通过体内外实验研究miR-145-5p靶向调控SMAD4基因介导TGF-β/Smad4信号通路对食管鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡的作用机制。

食管鳞状细胞癌中促癌作用的基因激活与抑癌作用的基因失活，及其相互作用的失衡是肿瘤发展的分子基础[17]。近年来，miRNA在肿瘤进程中的作用日益突出[18-19]。既往研究显示，在食管鳞状细胞癌中异常表达的miRNA通过调控某些关键原癌基因或抑癌基因介导肿瘤发生[20-21]。寻找食管鳞状细胞癌中异常表达的miRNA并预测及验证下游靶基因，对于食管鳞状细胞癌基础研究和临床应用具有重要价值。例如孟利峰等[22]研究表明，miR-149-5p可能通过调控Aurora-B表达参与食管鳞状细胞癌发展进程。CUI等[23]发现，miR-34a可通过抑制PLCE1发挥其抗癌作用，miR-34a/PLCE1轴可参与食管鳞状细胞癌转移，为食管鳞状细胞癌治疗提供了新的候选靶点。基于既往类似研究，研究之初我们假设miR-145-5p可能通过靶向调控SMAD4基因表达进而参与食管鳞状细胞癌生物学行为。

本研究对食管鳞状细胞癌组织及其癌旁正常组织免疫组织化学检测结果显示，SMAD4阳性颗粒主要表达于细胞浆或细胞核，且与癌旁正常组织相比，食管鳞状细胞癌组织中SMAD4阳性率明显升高；同时，qRT-PCR显示食管鳞状细胞癌组织miR-145-5p表达水平显著降低，SMAD4表达水平则显著增加。本文组织实验结果初步提示，miR-145-5p在食管鳞状细胞癌中低表达，SMAD4高表达，推测miR-145-5p高表达可通过靶向抑制SMAD4基因表达进而发挥抑癌作用。在细胞实验前的细胞株筛选结果显示，ECA-109细胞中的miR-145-5p表达量最低，可用于后续实验。同时，要了解miRNA的作用机制，关键在于鉴定靶基因[24-26]。本研究荧光素酶报告基因实验结果显示，miR-145-5p可靶向调控SMAD4。SMAD4已被报道在诸如胰腺肿瘤、宫颈癌、乳癌中异常表达[27-31]。为了解miR-145-5p及SMAD4对食管鳞状细胞癌生物学功能的影响，本实验基于不同转染组别，应用qRT-PCR、Western Blot、CCK8实验和流式细胞术检测分别检测关联基因mRNA及蛋白表达、细胞增殖活力和凋亡率等指标。结果显示，与空白对照和阴性对照细胞相比，上调miR-145-5p表达可促进促凋亡因子Bax表达增加，抑制SMAD4、TGF-β和抑制凋亡因子Bcl-2表达，并下调细胞增殖活力且提升细胞凋亡率；且抑制SMAD4基因表达可发挥同样作用；而下调miR-145-5p表达则导致Bax表达降低，SMAD4、TGF-β和Bcl-2的表达上升，细胞增殖能力上升，细胞凋亡率下降。同时，值得注意的是，在下调miR-145-5p表达水平同时抑制SMAD4基因表达则逆转了抑制siRNA-SMAD4表达处理细胞的积极作用，导致细胞增殖能力的提升和凋亡率的下降。上述结果提示，上调miR-145-5p或过表达SMAD4基因，可抑制TGF-β/Smad4信号通路的激活，且过表达miR-145-5p能够靶向抑制SMAD4基因而抑制食管癌细胞增殖能力、促进细胞凋亡。

综上所述，本研究对miR-145-5p以及SMAD4基因在食管鳞状细胞癌中作用研究的结果显示，SMAD4为miR-145-5p的下游靶基因，上调miR-145-5p表达可以通过下调SMAD4基因表达，抑制TGF-β/Smad4信号通路的激活，进而在调控肿瘤生物学行为中发挥重要作用。本研究为今后食管鳞状细胞癌的早期诊治和预后评估提供了新型分子标志物和机制通路解释。然而，本研究机制探究单纯基于细胞实验，缺乏进一步验证试验，未来可通过动物实验进一步验证细胞实验的结果，并确认下游潜在信号通路，从而为后续机制及临床转化研究提供理论指导。