赵 越 张明超 梁少姗 秦卫松 刘志红

系统性红斑狼疮(SLE)是一种以免疫异常活化和大量自身抗体产生为特征的系统性自身免疫性疾病,临床表现为多器官受累。狼疮性肾炎(LN)是SLE最常见且最严重的并发症之一,即便接受免疫抑制剂治疗,仍有10%～20%的 LN患者进展至终末期肾病(ESRD)[1]。因此,寻找新疗法控制LN免疫炎症反应对LN的临床治疗具有重要意义。

本中心在国际上首次提出“多靶点”疗法(MT)并牵头组织完成了国际上首个多中心随机对照临床研究(RCT),证实MT疗效显著优于传统疗法[2-3], 目前MT疗法已被多个国际权威指南推荐并推广至全球多个国家和地区,为LN治疗提供了新策略。我们前期的机制研究发现,与单药相比MT能够特异性抑制狼疮小鼠肾组织白细胞介素6(IL-6)/信号传导蛋白和转录激活物3(STAT3)信号通路[4],既往研究证实IL-6可作为重要炎症介质调控转录因子STAT3促进狼疮疾病进展,提示靶向抑制IL-6/STAT3信号可能是LN新药发现的有效途径。

白杨素(CHR)是一类天然黄酮,广泛存在于蜂胶、西番莲和蜂蜜等植物中[5]。近年来CHR的抗炎作用越发受到关注,Ha等[6]发现CHR可通过调控核因子κB(NF-κB)信号抑制巨噬细胞中干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)等炎症因子分泌,Lin等[7]研究发现CHR能够有效抑制脐静脉内皮细胞(HUVECs)中的 IL-6/STAT3信号通路。上述研究提示CHR具有抗炎、抗氧化等多种生物学活性,可能通过抑制IL-6/STAT3信号在LN中发挥疗效。本研究采用经典的自发性狼疮小鼠模型MRL/lpr对CHR在LN中的疗效及其机制进行探究,结果将为狼疮药物研发提供理论依据。

材料与方法

材料

实验动物 雌性MRL/lpr小鼠和C57BL/6小鼠均购自江苏艾凌菲生物科技有限公司。

主要试剂 CHR(Sigma);羧甲基纤维素钠(CMC-Na,selleck);RNA提取试剂盒(Takara);逆转录试剂盒(Takara);实时荧光定量PCR (RT-qPCR)试剂盒(ABI);BCA蛋白定量试剂盒(碧云天);p-STAT3抗体(CST);STAT3抗体(proteintech);β-actin抗体(proteintech);酶联免疫吸附测定(ELISA)检测试剂盒(R&D)。

方法

实验分组 将12只雌性MRL/lpr小鼠随机分为疾病组和CHR治疗组(每组n=6),选取6只同周龄雌性C57BL/6小鼠作为正常对照。治疗组从10周龄开始给药,每天口服饲喂CHR(160 mg/kg),持续给药8周。疾病组和正常对照组小鼠均给予等量溶剂处理。各组小鼠于18周龄时处死,采集脾脏、尿液、血液及肾组织样本进行后续检测。

过碘酸-雪夫(PAS)染色小鼠处死后取肾组织,置于4%的多聚甲醛中固定,乙醇洗脱后进行石蜡包埋,制备成3 μm厚度切片进行PAS染色,光学显微镜下观察肾组织形态学变化。

RT-qPCR将肾组织样本匀浆后参照Takara试剂盒说明抽提总RNA,用逆转录试剂盒(Takara)合成cDNA,利用SYBER Green法进行RT-qPCR检测肾组织中IL-6的mRNA表达水平。

蛋白免疫印迹(WesternBlot)RIPA裂解液抽提各组小鼠肾组织蛋白,经BCA法测定蛋白浓度后加入上样缓冲液,95 ℃变性5 min。蛋白样品经SDS-PAGE胶电泳,湿转法转印,脱脂奶粉封闭及一抗、二抗孵育后,滴加化学发光液后利用凝胶图像分析系统进行曝光拍照,Image plus pro(IPP)软件进行灰度值扫描分析。

尿蛋白/肌酐检测分别用Albuwell M 和 Creatinine companion kits(Exocell Laboratories)测定各组小鼠尿蛋白及尿肌酐,按照试剂盒说明书进行操作。

ELISA检测血清IL-6水平麻醉后摘取小鼠眼球,用1.5 ml EP管收集小鼠全血,1500 g离心10 min后取上清,参照R&D试剂盒说明检测血清中IL-6分泌水平。

统计学方法应用《Graphpad Prism 8》软件进行图表制作及数据分析,数据以均数±标准差表示,多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),两两比较采用Dunnett法,P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

CHR减轻狼疮小鼠脾脏重量及脾脏指数8周后处死各组小鼠发现，与正常对照组小鼠比较,MRL/lpr疾病组小鼠脾重及脾脏指数(脾重/体重)均显著上升,给予CHR治疗后可显著下调小鼠脾重及脾脏指数,差异有统计学意义(图1A、B)。

CHR缓解狼疮小鼠蛋白尿水平既往研究发现MRL/lpr狼疮小鼠模型随周龄增加疾病逐渐进展,在16周即可出现明显肾脏受累[8]。本研究通过ELISA检测各组小鼠蛋白尿肌酐比值(ACR)发现,与正常对照组相比MRL/lpr组小鼠ACR水平明显上调,而给予CHR治疗8周后能够有效缓解LN小鼠蛋白尿肌酐比值(图1C)。

图1 CHR对MRL/lpr小鼠脾重(A)、脾脏指数(B)及蛋白尿(C)的影响MRL/lpr:狼疮疾病组;CHR:白杨素治疗组；ACR：蛋白尿肌酐比值;**P<0.01

CHR缓解狼疮小鼠肾脏病理损伤程度在光镜下观察各组小鼠肾组织PAS染色切片,发现MRL/lpr小鼠肾小球体积明显增大,呈弥漫性系膜细胞增生,严重者可见肾小管萎缩及肾间质纤维化形成,CHR治疗可明显缓解上述病变(图2A),对PAS染色结果进行病理损伤定量分析后发现，CHR治疗可下调狼疮疾病组小鼠肾小球损伤评分(图2B)。以上结果提示CHR能够有效缓解MRL/lpr小鼠模型肾损伤。

图2 CHR治疗缓解MRL/lpr小鼠肾脏病理损伤PAS:过碘酸-雪夫染色;MRL/lpr:狼疮疾病组;CHR:白杨素治疗组；A:CHR治疗可缓解MRL/lpr组小鼠系膜增生及肾间质损伤(PAS，×1 000);B:根据PAS染色结果对各组小鼠肾损伤程度进行组织学评分;**P<0.01

CHR下调循环及肾组织炎症因子IL-6水平我们前期研究结果显示IL-6信号活化是LN疾病进展的重要诱发因素,MT治疗能够有效抑制IL-6/STAT3信号并显著缓解MRL/lpr狼疮小鼠的肾小球炎症反应[4]。通过ELISA实验和qPCR实验检测循环IL-6的分泌情况及肾组织局部IL-6 mRNA表达水平，发现与对照组相比,MRL/lpr小鼠循环及肾组织IL-6水平均显著上调,给予CHR治疗显著抑制IL-6表达及分泌(图3)。

图3 CHR抑制MRL/lpr小鼠循环及肾组织中IL-6水平IL-6:白细胞介素6;MRL/lpr:狼疮疾病组;CHR:白杨素治疗组。A:ELISA检测各组小鼠血清中IL-6水平;B:qPCR检测各组小鼠IL-6 mRNA水平,**P<0.01

CHR抑制MRL/lpr小鼠肾组织IL-6/STAT3信号活化为进一步探究CHR对MRL/lpr小鼠肾组织STAT3表达的影响,我们在8周给药结束后收集各组小鼠肾组织样本检测STAT3信号活化水平,结果发现与对照组相比,MRL/lpr小鼠肾组织p-STAT3表达显著上调且呈弥漫性分布,CHR给药能够显著抑制其表达水平(图4)。以上结果提示CHR可能通过抑制IL-6/STAT3信号异常活化缓解LN小鼠肾损伤。

讨 论

LN是我国继发性肾小球肾炎最常见的病因,约20%的LN患者会进展至ESRD[1]。LN的治疗目标是通过诱导期及维持期的治疗实现临床缓解,目前临床主要以糖皮质激素、免疫抑制剂作为一线治疗用药,尽管能够一定程度上延缓疾病进展并提高患者生存率,但其完全缓解率仍旧偏低[9]。本中心在国际上首次提出“多靶点”的治疗理念,建立了激素、吗替麦考酚酯和他克莫司联合的MT疗法并应用于LN治疗。中心牵头组织并完成了国际上首个多中心RCT证实MT疗效显著优于传统疗法,进一步通过机制研究发现MT能够特异性抑制MRL/lpr狼疮小鼠肾组织中IL-6/STAT3信号通路活化[4]。既往研究证实IL-6是狼疮疾病进展的重要炎性介质,IL-6分泌增加可迅速活化STAT3信号通路,STAT3的活性在正常生理状态下受到严格的调控,但在狼疮疾病状态下可出现异常激活,而过度激活的STAT3也会诱导 IL-6 产生,从而形成反馈环路加剧疾病进展[10-11]。因此,靶向抑制IL-6/STAT3 的化合物很可能成为治疗LN的潜在药物。

图4 CHR抑制狼疮小鼠肾组织IL-6/STAT3信号MRL/lpr:狼疮疾病组;CHR:白杨素治疗组;STAT3:信号传导蛋白和转录激活物3;p-STAT3:磷酸化STAT3；A:Western Blot检测各组小鼠肾组织p-STAT3水平;B: IHC检测各组小鼠p-STAT3表达及分布

黄酮类化合物又被称为生物类黄酮,是人类饮食中发现的最丰富的多酚类化合物,目前已鉴定出5 000余种不同的黄酮类化合物[12]。CHR是一种具有15碳骨架的类黄酮,广泛存在于西番莲、蜂蜜、蜂胶等植物中,具有多种生物学活性。已有研究报道CHR能够在阿霉素所致肾损伤、腺嘌呤诱导的大鼠慢性肾炎模型及糖尿病肾病小鼠模型中发挥疗效[13-15],但其在LN中的作用尚无研究报道。CHR能够抑制结肠癌、乳腺癌、前列腺癌等多个肿瘤进展[16],机制主要为诱发细胞凋亡、调控细胞周期、改善脂质过氧化和抗氧化状态、抑制血管生成、侵袭和转移等[17-18]。近年来随着研究深入,人们发现CHR除抗肿瘤作用之外还具有强大的抗炎作用,能够抑制INF-γ和TNF-α等炎症因子水平[19],影响前列腺素E2、环氧合酶2(COX-2)和NF-κB等炎症信号通路[20-21],值得注意的是,Darwish等[22]利用小鼠模型证实CHR治疗类风湿关节炎有效,齐世美等[23]报道 CHR能够显著抑制巨噬细胞中IL-6/STAT3信号通路抑制炎症反应。基于以上研究,我们推测CHR可能通过抑制狼疮小鼠肾组织中IL-6/STAT3信号通路在LN中发挥疗效。

本研究中,我们利用MRL/lpr狼疮小鼠模型探究 CHR在LN中的疗效,给予MRL/lpr小鼠CHR治疗8周后发现狼疮小鼠脾重及脾脏指数较疾病组均明显降低,提示CHR能够缓解狼疮鼠全身免疫活化状态。进一步检测各组小鼠蛋白尿水平和肾组织病理学改变发现CHR治疗显著缓解MRL/lpr小鼠肾脏局部损伤。机制研究发现CHR可抑制狼疮小鼠循环IL-6分泌及肾组织IL-6 mRNA表达水平并下调肾组织中p-STAT3水平,提示CHR治疗能够抑制狼疮小鼠肾组织中异常活化的IL-6/STAT3信号缓解LN疾病表型,本研究结果表明CHR等黄酮类化合物在LN等自身免疫性疾病治疗中具有极其广阔的应用前景。