王 杨 综述 李世军 审校

热射病是指人体暴露于热环境或剧烈运动后,热力作用于机体,机体产热与散热失衡,导致核心温度升高超过40℃,同时伴中枢神经系统功能障碍(如谵妄、抽搐,甚至昏迷)等,可进展为多脏器功能衰竭,如呼吸/循环衰竭、肝肾功能损伤、凝血功能障碍等一系列急危重症。热射病住院患者死亡率为14%～65%,ICU患者死亡率高达60%,是严重威胁人类生命健康的急重症[1]。热射病是体温调节由代偿阶段逐渐进展为失代偿阶段的过程,可对机体免疫系统产生严重影响,导致全身炎症反应综合征、弥散性血管内凝血等系列反应[2]。

表观遗传指在基因组或染色质内通过化学标记和分子修饰的方式,在不改变遗传物质序列的前提下调控基因表达,诱导机体产生一系列表型改变[3]。表观遗传可能参与了机体适应环境、免疫耐受、肿瘤发生等多种生物学过程。本文旨在从表观遗传的角度探索热射病的发生机制及对预后的影响。

热损伤的分子保护机制

蛋白质只能在较窄的温度窗内维持其最佳的形态和功能,温度过度升高有可能导致蛋白结构展开和折叠错误,影响细胞的正常状态和功能。错误折叠的蛋白可能是热应激反应(HSR)的启动信号,在这一启动信号下,由热休克转录因子(HSF)诱导的热休克蛋白(HSPs)表达升高,HSPs能够识别错误折叠蛋白,协助修正折叠状态,也可以标记错误折叠蛋白,通过溶酶体系统进行降解[4]。因此HSR诱导的HSPs高表达是防止热刺激导致蛋白质毒性所引起的细胞损伤重要机制之一。多种因素可削弱HSR,如衰老、缺乏对热的适应能力及可能存在的表观遗传因素等,都可能导致机体易发生热射病[5]。

热损伤中表观遗传的作用

机体长时间暴露于异常升高的温度时,生物物种对环境压力做出反应,在环境和遗传因素共同驱动下发生表型改变,从而适应新环境,这一过程称为热适应(AC)。表观遗传学是一套被广泛接受的通过调节表型可塑性使生物体适应环境的变化机制,可在环境压力下产生适应性的、短期或长期的基因表型可塑性,增加机体适应环境变化的潜力[6]。

表观遗传主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA对靶基因的调控等,这些机制在某些条件下启动或沉默特定基因的表达(图1)[5]。在热射病过程中,多种形式的表观遗传改变参与了疾病发生发展过程。

图1 表观遗传修饰的机制[3]

DNA甲基化DNA甲基化是目前研究最为深入的表观遗传机制,炎症相关蛋白DNA甲基化可能在热射病后机体易发生感染事件方面发挥了重要的作用。

DNA甲基化主要是在DNA甲基转移酶(DNMT)催化下,以CpG岛(一些富含CG序列的启动子区域)序列为主，将甲基从S-腺苷甲硫氨酸(SAM)转移到胞嘧啶残基的第5个碳上,形成5 mC,进而调控编码区相关蛋白的表达[7]。DNA甲基化分布通常呈双峰,调控区域要么高度甲基化,要么非甲基化,因此常作为基因表达的开关。

DNMT是调控DNA甲基化重要的酶。在哺乳动物中有3种DNMT：DNMT1、DNMT3a和DNMT3b,分别在不同阶段发挥促甲基化作用[8]。DNA亦可以在去甲基化酶,如Ten-Eleven转移酶(TET)调控下发生去甲基化,TET在5mC甲基上添加一个羟基形成5hmC,将5hmC转化回胞嘧啶,实现去甲基化的作用[9]。DNA的甲基化和去甲基化动态变化是机体适应不同环境的重要机制。

在哺乳动物、鱼类和一些无脊椎动物中,各种环境刺激,包括污染物、环境压力等,都会在全局水平或某些特定基因上改变DNA甲基化水平，影响生物的表型。Dorts等[10]研究表明斑马鱼暴露于高温和铜后,早期胚胎死亡率显著增加,孵化延迟,同时DNMT3表达上调。在鸡胚胎中,TET通过调节下丘脑来调节对热应激的生理反应[11]。在人体中,Bind等[12]认为环境温度和相对湿度通过DNA甲基化调节组织因子3、细胞间黏附分子1、Toll样受体2、糖皮质受体、长嵌核元素1(LINE1)和Alu等多种蛋白的水平。Murray等[13]发现小鼠在劳力型热射病(EHS)恢复之后第4天,骨髓来源的单核细胞(BMDM)中26 000多个CpG位点发生了甲基化,在第30天进一步增多;生物信息分析显示甲基化主要富集在免疫相关的信号通路上,如核因子κB(NF-κB)相关基因RelA、RelB和Bcl3启动子高度甲基化,而抑制基因如Nkfbia低甲基化;当用脂多糖(LPS)刺激EHS恢复后30 d的小鼠时,白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)分泌升高幅度显著低于对照组。提示EHS可能通过甲基化抑制了机体的免疫效能。

RNA甲基化甲基化是真核生物最常见的RNA修饰,占总RNA修饰的60%。RNA甲基化参与了RNA加工的所有方面,包括核输出、翻译、剪接等[14]。m6A甲基化是目前研究最多的RNA甲基化位点。在甲基化酶Mettl3/Mettl14和去甲基化酶FTO、ALKBH等的作用下,动态调整m6A甲基化平衡,最后在YTHDF家族相关蛋白的作用下,识别发生甲基化的碱基,调节mRNA的出核和翻译效率[15]。m6A甲基化在动物生长、繁殖、脂肪代谢、神经发育、免疫反应等生理过程中有着重要的作用。

研究表明,热刺激可通过m6A甲基化调控某些基因的表达。Lu等[16]在热刺激的绵羊肝脏中检测到大量m6A峰,进一步功能分析提示差异m6A基因在应激反应和脂肪代谢中显著富集。Heng等[17]研究表明在热刺激后的猪肝脏和脂肪中HSP70/HSP27表达明显升高;同时Mettl14、WTAP、FTO和YTHDF2等m6A甲基化相关酶的水平同样增加。但作者并未进一步探索m6A甲基化水平是否与HSP70表达相关。在人体肿瘤细胞中,Miao等[18]研究提示人黑色素瘤在热刺激后,热休克蛋白H1(HSPH1)蛋白5’UTR区A280和A286位点的m6A甲基化水平升高,进而调节相关蛋白表达。在Hela细胞中,热刺激调节m6A甲基化水平,促进了HSP70表达上调,且这种作用不需要通过5’UTR的帽结构实现,而是直接与真核起始因子3(elF3)结合,发挥调控作用[19]。Yu等[20]研究表明,在HepG2 细胞中,m6A甲基化酶Mettl3抑制之后HSP70 mRNA水平显著升高。这些结果都表明,HSP70表达水平与m6A甲基化水平有着明确的关系。在热损伤情况下,RNA甲基化是否参与调节HSPs表达,目前仍有待研究。

组蛋白修饰组蛋白是一种高度保守的、带正电荷的核蛋白,与带负电荷的DNA结合,形成染色质的基本结构单元-核小体。组蛋白是基因转录的重要调节因子,主要通过组蛋白N端尾部的翻译后修饰,如甲基化、乙酰化或磷酸化等实现[21]。DNA甲基化常常可以和组蛋白修饰以串扰的方式交流,参与染色质调节[22]。

在EHS之后2个月生物体可以获得AC记忆,在脱适应(De-Acclimation,DeAC)的休眠记忆时期,很多分子处于“警戒状态”,当再次发生损伤时,机体能快速再适应(Re-Acclimation,ReAC)以应对热损伤。有研究认为,组蛋白在这一过程中发挥了重要的作用。Friedrich等[23]研究提示中度热刺激拟南芥HSFA2和HSFA3复合物通过影响组蛋白H3赖氨酸4(H3K4)的高甲基化来促进转录记忆,维持机体稳态。Tetievsky等[24]研究提示组蛋白H3的磷酸化诱导了HSF1和热休克元件HSE的结合,激活了HSP70和HSP90的表达,随后组蛋白H4在整个AC、DeAC和ReAC过程中维持了可以随时转录的预警状态,当热暴露再次发生时,机体能够快速表达HSP70和HSP90,以缓冲热暴露对机体的影响。这就解释了DeAC之后可以快速ReAC的原因。

血清组蛋白可作为评估EHS严重程度的标志物。组蛋白通过与细菌DNA结合或破坏细胞膜发挥抗菌作用,并通过中性粒细胞胞外陷阱(NETs)释放到胞外,成为DAMPs加重机体损伤。Bruchim等[25]研究提示发生EHS的犬血清中组蛋白的水平和EHS的严重程度生物标志物之间呈显著正相关。Li等[26]研究提示EHS人群中血浆外泌体组蛋白H3水平与器官功能障碍和疾病严重程度显著相关(AUC=0.925)。

表观遗传学改变传递给后代的可能性

表观遗传信息跨代遗传是指在没有任何环境暴露的情况下,表观遗传信息在几代人之间的生殖系传递。既往报道,怀孕期间由于饥饿导致的热量限制,使子代较易出现肥胖、糖尿病等[27]。在热应激方面,多年以前就有关于热刺激通过表观遗传影响了果蝇和盐水虾的表型突变的相关研究[28]。在野生豚鼠中,同一个父亲在热暴露前后所生育的子代的DNA甲基化水平不同。热暴露后生育的子代在温度调节基因等相关基因CpG位点上出现高甲基化水平,提示热调控在哺乳动物中的可遗传性[29]。不仅如此,这种遗传还可能跨越了多代。Klosin等[30]研究表明,在F0代秀丽隐杆线虫的热应激后,HSP90的过表达至少持续了14代,这一效应可能与组蛋白H3水平的维持有关。这些结果表明表观遗传的后代传递可能是使生物适应频繁而强烈的气候变化关键机制。

事实上,表观遗传性状向后代传递是一个复杂的过程。体细胞中,有丝分裂要求表观遗传信息能够在每次细胞分裂发生的双重稀释下幸存下来,绝大多数细胞状态信息在传递到生物体的生殖系中已经被擦除或重新编程。这些信息的维护至少需要两个不同的载体之间的相互作用才能实现。生殖细胞也是需要关注的重点,因为发生表观遗传的基因如果需要向后代传递,取决于至少有一些从生殖系统对遗传信息的擦除和重编程过程中逃脱出去[6]。大部分组蛋白修饰的结果在精子发生过程中被去除;卵细胞中的基因组虽然由核小体组成,但经历了广泛的组蛋白置换之后,与体细胞的染色质也有了很大的不同。在受精之后,精子和卵细胞中的甲基化状态同样会发生很大改变,亦会影响甲基化信息的保留[6]。

虽然在哺乳动物中,生殖细胞和胚胎发育过程中发生的全局甲基化几乎完全消除了祖先的甲基化信息,但有一小部分基因可能以某种方式抵抗了甲基化的全局擦除,其中Tet抑制剂Stella的募集可能就是机制之一[31]。

表观遗传改变对器官的远期损伤

表观遗传在人体适应热刺激中有着重要的作用,有研究提示适应不良的表观遗传可能影响了某些器官的远期功能(图2)[22]。

图2 适应不良和适应性表观遗传反应之间差异[22]

EHS患者后期心血管事件发生率明显升高。在台湾的一项研究中,EHS发病2.1年后患者缺血性心脏病的概率增高了3.5倍[32]。在动物实验中,EHS小鼠恢复后30 d心肌出现了大量DNA甲基化,且发生甲基化的位点主要参与了各种应激和代谢反应的过程,提示心脏可能较易对未来刺激或压力事件产生不良反应[33],但暂无直接的证据提示表观遗传如何直接影响心肌的病变。

EHS后患者发生各种感染的风险明显增高[2]。在EHS时人体启动大规模免疫反应,试图修复器官损伤和功能障碍,但可能同时导致了肠道上皮细胞破坏,LPS移位致血液中,长期暴露于LPS的单核细胞或骨髓细胞会产生对于LPS的耐受性,这种现象受到了DNA甲基化的控制。在小鼠体内,有研究发现暴露于EHS的血液对LPS的刺激几乎没有反应,在BMDM中,这种反应与促炎基因上DNA甲基化水平相关[13]。

急性肾损伤是EHS最常见的并发症,多数研究均认为横纹肌溶解是急性肾损伤的主要原因,特别是肌红蛋白在肾脏中的长期堆积,同时合并全身炎症反应,及EHS期间脱水导致的肾脏灌注不足均加重了肾脏损伤。长期随访提示,EHS之后慢性肾脏病风险增加了4.4倍[34]。另有研究提示表观遗传参与了糖尿病肾病的进展,但目前仍缺乏EHS之后的慢性肾脏病发生与表观遗传相关的证据。

小结:生物处于恶劣环境时可启动表观遗传修饰,通过调节靶蛋白的表达,帮助机体适应环境的改变,并在某种程度上可向后代传递,从而推动物种总体发生适应环境的基因改变(图3)。但热射病如何引起表观遗传改变或何种表观遗传的改变,表观遗传改变是否确定是脏器远期损伤的主要原因以及热射病导致的表观遗传改变能否传递给后代,仍存在着许多问题亟待解决。

图3 表观遗传在热应激过程中的作用