王维 韩光宇 宋国权 李海林

结肠癌是全世界主要的消化道恶性肿瘤之一，部分患者在发现症状时往往伴有腹腔转移[1]。异基因造血干细胞移植是作为针对免疫应答的靶向治疗[2]，即移植物抗肿瘤（GVT）效应对结肠癌的治疗效果[3]。通过异基因造血干细胞移植模型，由脾淋巴细胞输注联合环磷酰胺治疗提高同种异体移植物的耐受能力[4]。在相关研究中发现PS 外翻是肿瘤细胞常见的现象，存在于原发的恶性病变[5]以及转移肿瘤细胞[6]；同时环磷酰胺也可降低T 淋巴细胞数量[7]。因此通过利用流式细胞仪检测小鼠CT-26结肠癌模型中外周血T 淋巴细胞及腹水中癌细胞PS 外翻表达情况评估小鼠GVT 效应，判断治疗结肠癌的效果。

1 材料与方法

1.1 材料 鼠源CT-26 结肠癌细胞购买于ATCC 细胞库CRL-2638。

1.2 主要仪器与试剂 流式细胞仪（BD），胎牛血清（FBS）（Hyclone），淋巴细胞分离液（碧云天公司），环磷酰胺（江苏恒瑞制药厂），PE-抗-CD4（Biolegend），FITC-抗CD3 抗 体（Biolegend），PS外翻试剂盒（BD）。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 细胞培养于含15%胎牛血清的1640 培养基中，置于37 ℃、5%CO2的培养箱内培养，2 d 进行换液。

1.3.2 结肠癌模型建立 通过将处于对数生长期的鼠源CT-26 结肠癌细胞制备成单细胞悬液，于各组小鼠皮下接种1×106个CT-26 小鼠细胞。

1.3.3 实验分组 A 组接种瘤细胞不予任何特殊处理；B 组接种于第7 天输注数量0.5×107/只脾淋巴细胞、第14 天输注数量0.5×107/只脾淋巴细胞、第21 天输注数量1.0×107/只脾淋巴细胞；C 组接种第3 天腹腔注射环磷酰胺100 mg/kg（20 mg/mL），于第7 天输注数量0.5×107/只脾淋巴细胞、第14天输注数量0.5×107/只脾淋巴细胞、第21 天输注数量1.0×107/只脾淋巴细胞。

1.3.4 流式细胞检测外周血T 淋巴 BALB/C 眼底静脉采血。各管分别为：（1）IgG1/IgG2 10 μL；（2）CD3 10 μL。在室温暗室下加入红细胞裂解液1 mL，室温下避光放置10 min，1 000 r/min 离心5 min，底物用PBS 洗涤2 mL，1 000 r/min 离心5 min，弃上清加入1 mL PBS，上机进行检测。

1.3.5 流式细胞仪检测腹水PS 外翻 用1mL注射器抽小鼠腹水，1 500 r/min 离心5 min收集。100μL 的Binding Buffer悬浮细胞。1μL Annexin V-EGFP 混匀后，同时加入1μL Propidium Iodide混匀。每只流式管加入500μL Binding Buffer，上机进行检测。

1.4 统计学处理 两组间计量资料的比较分析根据资料是否符合正态分布采用t检验或Mann-WhitneyU检验；多组间计量资料的比较分析根据资料的方差是否齐同采用方差分析或Kruskal-Wallis 检验。计数资料采用卡方检验或Fisher 精确概率检验进行比较。两组生存时间的比较采用Log-rank 检验（又称Mantel-Cox 检验）。采用 SPSS 22.0 和 GraphPad Prism 9.3 软件进行统计分析和绘图。P<0.05 认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血T 淋巴细胞亚群比例 流式细胞仪检测小鼠外周血CD3+T 细胞的百分比，其中CD3+T 细胞中A 组为（57.3±3.71）%，B 组为（66.5±3.85）%，C 组为（67.9±4.34）%，C 组较A 组高，差异有统计学意义（t=3.51，P<0.05），B 组较A 组高，差异有统计学意义（t=3.26，P<0.05），B 组与C 组比较差异无统计学意义（t=1.51，P>0.05），见图1。

图1 T淋巴细胞亚群比例

2.2 PS 外翻情况 A 组PS 外翻表达阳性率为（79.1±2.1）%，B 组与C 组均无腹水。实验进行到第14 天检测PS 外翻情况，A 组为（84.7±4.53）%，B 组 为（83.3±2.15）%，C 组 为（80.6±2.23）%，三组比较差异无统计学意义（F=2.36，P=0.17）。实验进行到第21 天检测PS 外翻情况，A 组为（85.4±1.1）%，B 组 为（58.3±3.31）%，C 组为（51.8±1.72）%，A 组与B 组、A 组 与C 组比较，差异均有统计学意义（t=2.12，P<0.05；t=3.74，P<0.05）。见图2。

图2 PS外翻表达情况

3 讨论

关于预测肿瘤的标记物一直是目前研究的重点方向，肿瘤细胞在发生发展过程中会出现PS 外翻情况，相关研究发现PS 可以作为肿瘤的标记物[8-9]。由于PS 可以作为肿瘤细胞的标记物，因此可以考虑作为新的治疗标记物[6]。关于PS 外翻在恶性肿瘤中的相关表达于1991 年已经进行了相关报道[10-11]。肿瘤细胞膜表达PS 现象[12-13]，不仅可以作为凋亡的信号[14]，而且可以作为标记物和治疗靶点[15-16]。通过实验分组发现B 组、C 组PS 外翻表达情况均较A 组下降明显，因此可以作为临床诊断指标。T细胞变化是决定着异基因免疫治疗的成败[17-19]，因此通过检测T 细胞分群可以明确治疗效果[20]。实验发现B、C 组在淋巴细胞输注后，CD3+T 细胞表达均较A 组显著上升（P<0.05）。本实验利用流式细胞仪检测结肠癌小鼠CT-26 外周血T 淋巴细胞分群及腹水PS 外翻情况可以反映诱导小鼠GVT 效应，评估结肠癌的疗效。