党如意，叶 超，冯 航，冯 杰，杨增岐

(西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

腹泻是犊牛常见的一种胃肠道疾病，通常在其出生后2 d～3 d开始发病，主要临床表现为消化不良和腹泻[1-2]。在大规模饲养中，犊牛腹泻发生率高达90%～100%，病死率达50%以上，对犊牛的生长、发育、成活等具有很大影响[3-4]。犊牛腹泻的发病原因复杂，主要有感染性因素和非感染性因素，其中感染性因素包括病毒、细菌、寄生虫感染等[5]。能够引起犊牛腹泻的致病菌主要有致病性大肠埃希氏菌[6]、蜡样芽孢杆菌[7]、产气荚膜梭菌[8]等。其中，致病性大肠埃希氏菌是引起1周龄内犊牛腹泻的主要致病菌，其侵入犊牛后可以释放多种肠毒素引起腹泻[9]。犊牛从污染的环境中摄取菌体，或者由于饲养管理等因素引起肠道内环境遭到破坏、肠道菌群失调、免疫力降低，菌体大量繁殖产生大量毒素引起腹泻[10]。犊牛发生腹泻后，抵抗力下降，肠道菌群紊乱，极易诱发外源或条件性致病原感染，加剧病情和死亡[11]。

西北地区某牛场于2020年9月份开始陆续出现犊牛腹泻引起的死亡，发病牛均为7日龄～10日龄，粪便带血，且在出现腹泻后3 d～5 d死亡，剖检可见肝脏轻度肿大、边缘泛白。2021年1月，该牛场因腹泻死亡犊牛达20余头。采集发病犊牛的肝脏和脾脏送西北农林科技大学动物医学院重大动物疫病综合防控与净化实验室进行检测，通过细菌分离培养、分子生物学诊断以及动物致病性试验，结合病牛的临床表现，最终确定为蜡样芽孢杆菌和大肠埃希氏菌混合感染所致。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源和实验动物 无菌采集该养殖场腹泻犊牛肝脏和脾脏2份，其中1份用于总DNA的提取，置-80℃保存备用；1份用于细菌分离。昆明小鼠购自中国人民解放军空军军医大学实验动物中心。

1.1.2 主要试剂 DNA提取试剂盒，南京诺唯赞生物科技股份有限公司产品；PCR Mix，北京市康润生物科技有限公司产品；药敏纸片，杭州滨和微生物试剂有限公司产品；部分兽用药药敏片为本实验室按照欧洲抗菌药物敏感试验委员会(EUCAST)标准制备；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 主要仪器 高压灭菌器(YXQ-50SⅡ)，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司产品；冰箱，青岛海尔股份有限公司产品；电子天平感量，奥豪斯仪器有限公司产品；恒温水浴锅，上海世泽生物科技有限公司产品；恒温振荡器，上海精宏实验设备有限公司产品；高速低温离心机，赛默飞世尔科技公司产品；PCR仪，安诺伦(北京)生物科技有限公司产品；核酸电泳仪，北京六一生物科技有限公司产品；凝胶成像系统，北京百晶生物技术有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 需氧性致病菌的分离与纯化 将采集样品无菌接种于50 mL/L脱纤维绵羊血琼脂，37℃培养24 h，记录菌落生长特征，挑取能使血平板溶血的单个菌落，观察菌体形态。将初步分离的可疑菌落接种于普通营养琼脂培养基，37℃恒温培养24 h，观察菌落生长状况，记录菌落生长特征，挑取单菌落，革兰氏染色、镜检，观察记录菌体形态。挑取上述分离培养得到的单菌落接种于5%脱纤维绵羊血培养基上，37℃恒温培养24 h，观察结果；再挑取单菌落进行纯化培养，革兰氏染色镜检；接种于肉汤中，在37℃恒温培养24 h，保菌备用。

1.2.2 厌氧性致病菌的分离与纯化 取少量样品，充分研磨，用1 mL生理盐水稀释，吸取100 μL稀释液加入厌氧肉肝汤中，37℃培养18 h，收集1 mL厌氧肉肝汤培养物，6 000 r/min离心30 s，弃上清，用接种环蘸取少量沉淀于TSC培养基，厌氧环境37℃培养24 h，将TSC培养基上的菌落接种至5%脱纤维绵羊血琼脂上，厌氧环境37℃培养24 h，观察菌落形态，革兰氏染色镜检；接种于厌氧肉肝汤中，在37℃恒温培养24 h，保菌备用。

1.2.3 分子生物学诊断 利用DNA提取试剂盒分别提取需氧和厌氧条件下获取培养物的DNA，以此为模板用16S rDNA基因引物进行PCR扩增，以大肠埃希氏菌标准株(ATCC25922)为阳性对照。

1.2.4 动物致病性试验 取所分离细菌培养物于无菌离心管中，用生理盐水调节麦氏浓度到0.5，随后以200 μL/只分别腹腔注射6只8周龄雄性昆明小鼠，作为试验组；同时以200 μL/只生理盐水腹腔注射6只8周龄雄性昆明小鼠作为对照组。一定时间后观察小鼠状态，如有死亡，对其进行剖检。

1.2.5 药敏试验 用药敏纸片琼脂扩散法[11]分别对分离的蜡样芽孢杆菌(10种抗生素)和大肠埃希氏菌(19种抗生素)进行药敏试验。

2 结果

2.1 临床诊断

病牛精神沉郁，喜躺卧，吮乳减少或者废绝，部分犊牛还出现瘤胃鼓气并呈现反复发作，平均体温在37.5℃左右。病牛排粪量减少，排便次数增加，初期排不成形、黄或白色软粪，随着病症加重，病牛排青灰色稀粪，内含黏液、血液等混杂物。听诊病牛心率增加、心音增强、肠蠕动音高朗；眼球凹陷。发病后期犊牛站立不稳，全身战栗，濒死期倒地，四肢作划水状。

2.2 细菌学诊断

需氧条件下获取培养物镜检发现为大量革兰氏阳性杆状菌和少量中等大小的革兰氏阴性杆状菌；厌氧条件获取的培养物在TSC培养基上出现单一白色菌落，镜检发现为单一中等大小的革兰氏阴性杆状菌，形态与需氧培养物中的革兰氏阴性杆菌一致。

2.3 分子生物诊断

分别对需氧和厌氧培养物DNA进行PCR扩增，扩增产物大小均为1 386 bp(图1)。然后对扩增产物进行测序比对分析，结果发现需氧培养条件下培养的革兰氏阳性菌扩增产物和NCBI中的1株蜡样芽孢杆菌的同源性为100%；需氧培养条件下培养的革兰氏阴性菌和厌氧环境下培养的革兰氏阴性扩增产物与大肠埃希氏菌ATCC 44102的同源性都为99.89%，判定不同条件下分离的2株革兰氏阴性菌为相同的克隆株。

1.DNA标准DL 2 000 ；2.阳性对照；3.阴性对照；4.需氧型革兰氏阳性菌DNA扩增产物；5.需氧型革兰氏阴性菌DNA扩增产物；6.厌氧型革兰氏阴性菌DNA扩增产物

2.4 动物致病性试验

分离的大肠埃希氏菌培养物接种小鼠36 h全部死亡，剖检，取肝脏和肠道样本涂片镜检，发现革兰氏阴性杆状菌；分离的腊样芽孢杆菌培养物接种小鼠24 h后全部死亡，剖检发现小鼠肝脏肿大充血，肝脏涂片镜检，可观察到中等大小革兰氏阳性杆状菌。

2.5 药敏试验

按照EUCAST标准进行判定，分别对分离的致病性大肠埃希氏菌和蜡样芽孢杆菌进行药敏试验(表1、表2)。

表1 大肠埃希氏菌药敏试验结果

表2 蜡样芽孢杆菌药敏试验结果

3 讨论

在大规模饲养中，犊牛腹泻是犊牛常见的胃肠道疾病，具有很高的发病率[1,12]。该牛场发病犊牛在发病初期出现明显的排便次数增加，随后病牛排青灰色恶臭稀粪，内含黏液、血液等混杂物，最后发病犊牛无法站立，濒死期倒地，整个发病过程持续3 d～5 d左右。采集发病犊牛的肝脾在需氧条件下进行培养得到一株致病菌，后经分子生物学诊断确定为致病性蜡样芽孢杆菌。该致病菌属于革兰氏阳性、β溶血性的杆状细菌，犊牛感染会引起水样腹泻和腹痛，很少伴有呕吐[7]，该症状和发病犊牛症状相符。另外，发病犊牛病情进展较快，并出现腹痛，开始怀疑为魏氏梭菌感染，但是对采集的肝脾进行厌氧培养，发现有单一白色菌落，和产气荚膜梭菌的黑色伴随白圈的菌落不符。随后，对厌氧条件培养物进行分子生物学鉴定，序列比对确定为大肠埃希氏菌。致病性大肠埃希氏菌感染多发生在10日龄以内的犊牛，特别是产后的1 d～3 d内，四季均可发生。临床上致病性大肠埃希氏菌分为败血型、肠毒素型和肠型[13]，其中产肠毒素型大肠埃希氏菌感染犊牛腹泻最为明显，病牛排黄色恶臭粪便，继而出现浅灰色水样腹泻，混有血块、血丝和气泡[14]。产肠毒素型大肠埃希氏菌的症状和该牛场发病犊牛的症状也较为相符。

综上所述，根据流行病学特点、临床表现、病理剖检以及实验室诊断，确诊该牛场犊牛腹泻是由致病性蜡样芽孢杆菌和致病性大肠埃希氏菌混合感染。致病性细菌引起的犊牛腹泻发病率较高，本研究对该病的防治提出以下建议：首先对有临床症状的犊牛进行隔离，以对症治疗、解毒保肝为原则，结合药敏试验，选择对致病性大肠埃希氏菌和蜡样芽孢杆菌分别敏感的抗菌药物(如头孢噻呋钠联合恩诺沙星)各一种进行，切忌多种抗菌药物同时使用。然后配合中药处方：黄柏、黄芩、猪苓、泽泻、车前子、茯苓、白芍、神曲、麦芽、山楂、石榴皮、党参、当归、熟地、甘草各10 g，水煎，口服2次～3次。对于体温下降明显、脱水严重的犊牛，给予抗生素治疗的同时配合50 g/L葡萄糖生理盐水、复方氯化钠、维生素B1、碳酸氢钠等，每天2次静脉注射[15]。保持牛舍通风保暖和干燥，彻底清理厩舍内所有病牛排泄物和被污染的垫料、用具等，进行全面消毒。通过采取以上处理措施，该牛场犊牛病情得到有效控制，未再出现新的病例，被隔离病牛经过治疗也基本康复。

目前，在我国的养牛地区和规模养殖场，犊牛腹泻的发生很普遍，且一旦发生，极易引起死亡，使养牛户或养牛企业蒙受重大损失，严重威胁养牛业的健康发展，故需引起足够重视。希望本文所做工作能对养牛户或养殖企业提供参考。