吕一舟，刘珍秀，潘兴学，王文丽，张为民，宋晓平，麻武仁，刘迎秋，范云鹏

(西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

规模化养殖中动物免疫抑制性疾病已普遍存在[1-4]，免疫抑制性疾病可破坏淋巴细胞、单核巨噬细胞等，使动物免疫系统受损、抗病能力降低，从而导致条件性致病菌感染，给养殖业带来巨大损失。朱砂七是蓼科蓼属植物毛脉蓼根的块茎，味苦，微涩，性凉。有清热解毒、止血止泻功效[5-6]，朱砂七多糖(Polygonumcillinervepolysaccharide,PCP)是其主要有效成分之一。中药多糖具有抗氧化[7-8]、抗肿瘤[9]、抗病毒[10]、免疫调节[11-12]等多种生物活性。本课题组前期进行了PCP的提取纯化、结构鉴定等，并初步证明朱砂七多糖具有抗氧化活性[6]。PCP对临床分离的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和沙门氏菌具有一定的抑制效果，但对其免疫活性的相关研究较少。本研究采用MTT法、ELISA等方法，分别检测PCP对鸡外周血淋巴细胞和小鼠脾淋巴细胞的毒性、细胞增殖及小鼠脾淋巴细胞分泌IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ细胞因子的影响，为朱砂七多糖免疫增强活性研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 朱砂七多糖(含量87.2%)，西北农林科技大学中兽医实验室制备；肝素钠、淋巴细胞分离液、1640培养液、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、刀豆蛋白(Con A)、脂多糖和青链霉素均为北京索莱宝科技有限公司产品；胎牛血清，浙江天杭生物科技有限公司产品；二甲基亚砜(DMSO)，天津市科密欧化学试剂有限公司产品；ELISA(IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ)试剂盒，上海酶联生物科技有限公司产品；200目细胞筛，美国Biologix公司产品。

1.1.2 试验用动物 成年公鸡，西北农林科技大学动物实验中心提供。SPF级昆明小鼠，20 g～25 g，雌雄各半，购自成都达硕实验动物有限公司。

1.1.3 主要仪器 MCO-18AC二氧化碳培养箱，普和系株式会社产品；CKX31SF倒置显微镜，日本OLYMPUS公司产品；YT-CJ-2N超净台，北京亚泰科隆仪器技术公司产品；TDL-80-2B离心机，上海安亭科学仪器公司产品；FC酶标仪，美国Thermo公司产品；LDZX-50KBS立式压力灭菌器，上海申安医疗器械厂产品；DHG-9140A电热鼓风干燥箱，上海中器实业有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 液体配制 Hank's液，先配制A液和B液。A液：称取KCl 8 g、NaCl 160 g、MgCl2·6H2O 2 g、MgSO4·7H2O 2 g，溶解于800 mL双蒸水中，与100 mL 2.8% CaCl2溶液混合，加水至1 000 mL，115℃灭菌15 min，4℃保存；B液：称取KH2PO41.2 g、Na2HPO4·12H2O 3.04 g、葡萄糖 20 g，溶解到800 mL双蒸水中，与100 mL 0.4%酚红溶液混合，加水至1 000 mL 108℃灭菌15 min，4℃保存。取A液及B液各1份与18份双蒸水混合即得Hank′s液，配好后108℃高压灭菌15 min。临用前用56 g/L NaHCO3调pH为7.2～7.4，加青霉素、链霉素各100 IU/mL。细胞培养液：在所用的1640培养基中添加100 mL/L胎牛血清。

1.2.2 鸡外周血淋巴细胞和小鼠脾淋巴细胞的制备 从鸡心脏采血10 mL至含有肝素钠(2 mg/mL)的注射器中，与Hank′s等比混匀，加入等体积淋巴细胞分离液至上层，2 500 r/min离心20 min。吸取中间的云雾层于另一离心管中，并与等体积的Hank′s液混匀，2 000 r/min离心15 min。弃去上清液，加入2 mL Hank′s液，2 000 r/min离心10 min。弃去上清，加入细胞培养液重悬细胞，得鸡外周血淋巴细胞悬液。取小鼠脾脏置200目细胞筛上研磨，用Hank′s液冲洗。在离心管中提前加入4 mL的淋巴细胞分离液，取4 mL研磨好的脾脏组织悬液，缓慢地沿管壁加入到分离液的上层，2 500 r/min离心20 min。吸取中间的云雾层，后续步骤与上述方法一致，得小鼠脾淋巴细胞悬液。

1.2.3 PCP对鸡外周血淋巴细胞的毒性 将PCP用细胞培养液稀释为31.25、15.63、7.81、3.91、1.95 μg/mL，后面的试验均按此方法配药。将鸡外周血淋巴细胞(1×106个/mL)，接种到96孔板中，100 μL/孔。试验分2组，对照组每孔加细胞培养液100 μL；试验组每孔各加不同浓度的PCP 100 μL，做4个重复。置37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱中培养48 h。提前4 h向每孔中加MTT 30 μL，继续培养4 h，弃去部分培养基，每孔加DMSO 100 μL，振荡10 min，在570 nm处检测OD值。

1.2.4 MTT法检测鸡外周血T淋巴细胞增殖 将鸡外周血淋巴细胞悬液以80 μL/孔 接种到96孔板中。设空白对照组每孔加细胞培养液120 μL，阳性对照组每孔加Con A(10 μg/mL)20 μL+细胞培养液100 μL，试验组每孔加Con A 20 μL+各浓度PCP 100 μL，4个重复。置培养箱中培养48 h。后续步骤与上述试验一致，570 nm处检测OD值。

1.2.5 MTT法检测PCP对小鼠脾淋巴细胞的毒性 将小鼠脾淋巴细胞接种到96孔板中，100 μL/孔。试验分2组，对照组每孔加细胞培养液100 μL；试验组每孔加各浓度的PCP 100 μL，做6个重复。置于培养箱中培养48 h。后续步骤与上述试验一致，在570 nm处检测OD值。

1.2.6 PCP对小鼠脾T淋巴细胞增殖的影响 将小鼠脾淋巴细胞接种到96孔板中，80 μL/孔。试验分3组：空白对照组加细胞培养液120 μL；阳性对照组每孔加Con A 20 μL+细胞培养液100 μL；试验组每孔加Con A 20 μL+各浓度PCP 100 μL，做4个重复。置于培养箱中培养48 h。后续步骤与上述试验一致，在570 nm处检测OD值。

1.2.7 PCP对小鼠脾B淋巴细胞增殖的影响 将小鼠脾淋巴细胞接种到96孔板中，80 μL/孔。试验分3组：空白对照组加细胞培养液120 μL；阳性对照组每孔加LPS(10 μg/mL)20 μL+细胞培养液100 μL；试验组每孔加LPS 20 μL+各浓度PCP 100 μL，做4个重复。置于培养箱中培养48 h。后续步骤与上述试验一致，在570 nm处检测OD值。

1.2.8 ELISA检测IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ水平 将小鼠脾淋巴细胞接种到24孔板中，800 μL/孔。设3个组：空白对照组每孔加细胞培养液1.2 mL；阳性对照组每孔加Con A 200 μL+细胞培养液1 mL；试验组每孔加Con A 200 μL+各浓度的PCP 1 mL。置37℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养48 h，收集细胞上清，按IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ试剂盒说明进行操作，450 nm处检测各OD值，计算IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ含量。

1.2.9 数据分析 用统计学软件SPSS 23.0分析数据，数据以“平均数士标准差(Mean±SD)”表示，组间比较用单因素方差分析，以Duncan′s法进行显著性检验。不同字母代表差异显著(P<0.05)。

2 结果

2.1 PCP对鸡外周血淋巴细胞的毒性

PCP在15.63、7.81、1.95 μg/mL时，OD值均高于空白对照组，其中在7.81 μg/mL时差异显著(P<0.05)，在15.63 μg/mL和1.95 μg/mL差异不显著(P>0.05)。31.25 μg/mL和3.91 μg/mL的OD值低于空白对照组，差异不显著(P>0.05)。表明PCP在1.95 μg/mL～31.25 μg/mL对鸡外周血淋巴细胞没有毒性，且在7.81 μg/mL时可显著促进鸡外周血淋巴细胞的增殖(图1)。

图1 PCP对鸡外周血淋巴细胞的毒性试验(n=4)

2.2 MTT法检测鸡外周血T淋巴细胞的增殖

PCP在31.25、7.81、3.91、1.95 μg/mL时OD值均显著高于空白对照组(P<0.05)。 PCP在7.81 μg/mL时OD值显著高于Con A单独刺激组(P<0.05)，31.25、3.91和1.95 μg/mL的OD值高于Con A单独刺激组，但差异不显著(P>0.05)。表明PCP能够协同Con A促进鸡外周血T淋巴细胞的增殖(图2)。

图2 PCP对鸡外周血T淋巴细胞增殖的影响(n=4)

2.3 MTT法检测PCP对小鼠脾淋巴细胞的毒性

PCP在1.95 μg/mL～7.81 μg/mL时OD值均高于空白对照组，其中1.95 μg/mL时差异显著(P<0.05)。表明PCP浓度在1.95～31.25 μg/mL范围内对小鼠脾淋巴细胞无毒性(图3)。

图3 PCP对小鼠脾淋巴细胞毒性试验(n=6)

2.4 PCP对小鼠脾T淋巴细胞增殖的影响

不同浓度的PCP协同Con A时，PCP为1.95 μg/mL～31.25 μg/mL时的OD值与Con A单独刺激相比，显著升高(P<0.05)。表明在1.95 μg/mL～31.25 μg/mL范围内，PCP协同Con A可以显著促进小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖(图4)。

图4 PCP对小鼠脾T淋巴细胞增殖的影响(n=4)

2.5 PCP对小鼠脾B淋巴细胞增殖的影响

不同浓度的PCP与LPS共同刺激时，PCP在1.95 μg/mL～31.25 μg/mL范围内的OD值与LPS单独刺激相比，显著升高(P<0.05)。表明PCP在1.95 μg/mL～31.25 μg/mL范围内可以显著促进小鼠脾脏B淋巴细胞的增殖(图5)。

图5 PCP对小鼠脾B淋巴细胞增殖的影响(n=4)

2.6 PCP对IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ分泌的影响

PCP为1.95 μg/mL～31.25 μg/mL时，IL-2分泌量均高于Con A组和空白对照组，PCP为3.91、7.81、15.63、31.25 μg/mL时，IL-2分泌量显著高于Con A单独刺激组和空白对照组(P<0.05)。表明PCP在3.91 μg/mL～31.25 μg/mL范围内可显著促进小鼠脾脏淋巴细胞分泌IL-2(图6A)。

PCP浓度在7.81 μg/mL和31.25 μg/mL时，IL-4分泌量高于Con A组和空白对照组，但差异不显著(P>0.05)。浓度在1.95、3.91、15.63 μg/mL时，IL-4分泌量低于Con A单独刺激组和空白对照组，差异不显著(P>0.05)。表明PCP在1.95 μg/mL～31.25 μg/mL时对IL-4的分泌无显著促进作用(图6B)。PCP在1.95 μg/mL～31.25 μg/mL时，IL-10分泌量与Con A组和空白对照组相比，均显著增加(P<0.05)。表明PCP在上面浓度范围内协同Con A可以促进小鼠脾淋巴细胞分泌IL-10(图6C)。PCP在15.63 μg/mL时，IFN-γ高于空白对照，但差异不显著(P>0.05)。与Con A组相比，PCP在1.95 μg/mL～31.25 μg/mL时，IFN-γ分泌量均显著增加(P<0.05)。表明PCP在1.95 μg/mL～31.25 μg/mL范围内对小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ有明显促进作用(图6D)。

A.PCP对IL-2分泌的影响(n=4)；B.PCP对IL-4分泌的影响(n=4)；C.PCP对IL-10分泌的影响(n=4)；D.PCP对IFN-γ分泌的影响(n=6)

3 讨论

T淋巴细胞的增殖常被用于研究药物活性[13]。本文PCP浓度为1.95 μg/mL～31.25 μg/mL时，对鸡外周血淋巴细胞无毒性，且在7.81 μg/mL时，可以促进淋巴细胞增殖。表明PCP对鸡外周血淋巴细胞增殖有一定的促进作用。脾脏中有T和B两种淋巴细胞，淋巴细胞在体外受到刺激物刺激后，会向淋巴母细胞转化和增殖。刀豆蛋白(Con A)和植物血凝素(PHA)在体外可以刺激T淋巴细胞增殖，脂多糖(LPS)能够刺激B淋巴细胞增殖[15]。淋巴细胞的转化率和增殖水平反应机体的免疫功能强弱，可作为测定机体免疫功能的一个指标[14]。从鸡骨草中提取的多糖在125 μg/mL～375 μg/mL可剂量依赖性的促进小鼠脾细胞增殖[15]；将10 μg/mL浓度的苜蓿多糖作用于淋巴细胞，培养24 h，B淋巴细胞增殖效果最好[16]。本研究PCP浓度在1.95 μg/mL～31.25 μg/mL时，T淋巴细胞增殖显著高于Con A组，B淋巴细胞的增殖显著高于LPS组，表明PCP对脾淋巴细胞的增殖具有较好的促进作用。

活化的T细胞可以产生IFN-γ多效性细胞因子，具有抗癌和抗感染的作用，在炎症调节中具有促炎和抗炎的双重作用[17]，常以IFN-γ评估T细胞的活化程度。IL-2由活化的T淋巴细胞产生，具有免疫增强作用，促进IL-2的分泌可以有效控制受感染个体的病毒血症[18]。从软紫草根中提取的多糖在40 μg/mL和200 μg/mL能促进小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ[19]；蛹虫草多糖和Con A协同可刺激小鼠脾脏中的淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-2。本研究PCP浓度为1.95 μg/mL～31.25 μg/mL时能显著促进IL-2的产生。

Th2细胞可以分泌抗炎因子IL-10，其能有效抑制IL-2和IFN-γ的合成和T细胞增殖。IL-10可防止过度的免疫应答，能协同IL-4和TGF-β抑制LPS诱导巨噬细胞释放NO。IL-10也能够促进B细胞增殖和自身抗体的产生。紫草、鱼腥草、柴胡和杜仲多糖在体外可以外周血单核细胞(PBMC)分泌IL-10。本研究PCP浓度为1.95 μg/mL～31.25 μg/mL时，对IL-10和IFN-γ的生成有明显的促进作用，但对IL-4的生成无明显促进作用。

本研究表明，PCP为1.95 μg/mL～31.25 μg/mL时对鸡外周血淋巴细胞和小鼠脾淋巴细胞没有毒性，浓度为7.81 μg/mL时可显著促进鸡外周血淋巴细胞增殖。浓度为1.95 μg/mL～31.25 μg/mL时，能协同Con A促进小鼠T淋巴细胞增殖，协同LPS促进B淋巴细胞增殖，浓度为3.91 μg/mL～31.25 μg/mL时，可以显著促进IL-2的分泌，在1.95 μg/mL～31.25 μg/mL可显著促进细IL-10和IFN-γ的分泌，表明朱砂七多糖在体外具有较好的免疫增强活性。