严杜建，安利彦，谢丹阳，李高芸，林彭楚彬，吴晨晨*

(1.阿克苏职业技术学院，新疆阿克苏 843000；2.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；3.新疆农业大学动物科学学院，新疆乌鲁木齐 830000)

内毒素(endotoxin)是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，也叫脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)，也是其他微生物(如立克次氏体、衣原体、螺旋体等)细胞璧中的结构成分。脂多糖分为3部分，“O”特异性侧链(也称“O”抗原)、核心多糖及类脂体A，类脂体A作为脂多糖的毒性成分在内毒素免疫中起了重要的作用。内毒素一方面会直接影响动物繁殖性能，使动物胚胎早期死亡、发育缓慢，产出的胎儿体质差、死亡率高等；另一方面会通过发生一系列的免疫反应，间接影响畜禽繁殖性能。有关内毒素的研究主要集中于免疫性能的影响。本次试验以小鼠为模型，旨在研究内毒素对雌性小鼠繁殖性能的影响，为减少生产中畜禽体内内毒素对其繁殖性能的影响提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 8周龄体重30 g左右的昆明小鼠，雌性30只，雄性15只，购于西安交通大学实验动物中心。

1.1.2 主要试剂和仪器 脂多糖，西格玛奥德里奇贸易有限公司产品；小鼠分泌性免疫球蛋白A(sIgA)酶联免疫分析试剂盒、小鼠脂多糖(LPS)酶联免疫分析试剂盒、小鼠促卵泡素(FSH)酶联免疫分析试剂盒、小鼠促黄体生成素(LH)酶联免疫分析试剂盒、小鼠雌二醇(E2)和孕酮(P4)酶联免疫分析试剂盒均为晶美公司产品；全波段酶标仪为Tecan公司产品。

1.2 方法

1.2.1 实验动物的分组和样品收集 所有小鼠在购入后适应环境7 d，然后将雌性小鼠分为对照组15(0.01 mol/L PBS)，染毒组15只(LPS 1 mg/kg)进行灌胃处理。灌胃内毒素第8天将雌性小鼠与正常雄性小鼠合笼并确定妊娠情况。小鼠分笼后开始记录雌性小鼠的采食量和体重。雌性小鼠分娩后5 d和15 d，记录仔鼠存活率、体长、窝重、畸形和死胎等；并收集母鼠血液、子宫、回肠、结肠和仔鼠的肠道，快速冷冻于液氮中，置-80℃保存用于ELISA检测LPS和sIgA,收集血清用ELISA的方法检测生殖激素E2、P4、FH和FSH。

1.2.2 ELISA检测 在收集到的子宫、回肠、结肠和仔鼠肠道中分别加入1 mL的PBS(pH=7.4)，用匀浆器将标本匀浆充分，置于2 mL的离心管中离心25 min (3 000 r/min)，收集上清液于另一干净离心管中备用。将收集的血清从4℃冰箱中取出，备用，后续操作方法见试剂盒说明书。

1.2.3 统计分析 用GraphPad Prism 8计算并检验(t检验)组间数据的显著性，数据以Mean±SD表示。结果中P值小于0.05差异显著(*P<0.05)，P值小于0.01差异极显著(**P<0.01)。

2 结果

2.1 内毒素对雌性小鼠繁殖性能指标的影响

雌性小鼠妊娠期间每日平均采食量与平均体重呈现逐步增长的状态。对照组与染毒组的平均体重差异不显著(P>0.05)；对照组的平均采食量显著高于染毒组(P<0.05)(图1)。分娩后5 d，染毒组新生仔鼠的死亡率显著低于对照组(P<0.05)， 染毒组雌性小鼠新生仔鼠数量、新生仔鼠体重与对照组之间无显著性差异(P>0.05)，对照组仔鼠平均出生体长显著性的高于染毒组(P<0.05)(图2)。

A.母鼠平均体重对比；B.平均体重变化趋势；C.母鼠每日平均采食量对比；D.母鼠平均每日采食量变化趋势

图2 新生仔鼠死亡率(A)，雌性小鼠的产仔数(B)，仔鼠平均出生体重(C)，仔鼠平均初生体长(D)

2.2 内毒素对母鼠和仔鼠体内组织LPS与sIgA的影响

分娩后5 d，结肠中的LPS含量，对照组结肠、回肠和子宫组织LPS的含量与染毒组无显著性差异(P>0.05)；仔鼠肠道的LPS含量，染毒组极显著高于对照组(P<0.01)。分娩后15 d，结肠中的LPS含量，对照组结肠、回肠和子宫组织LPS的含量显著高于染毒组(P<0.05)；仔鼠肠道的LPS含量，染毒组极显著高于对照组(P<0.05)。分娩后5 d，结肠中的sIgA含量，对照组结肠和子宫组织sIgA含量与染毒组无显著性差异(P>0.05)；回肠中的sIgA含量，染毒组极显著高于对照组(P<0.01)。分娩后15 d，对照组结肠和回肠的sIgA含量与染毒组无显著性差异(P>0.05)；子宫中的sIgA含量，对照组极显著高于染毒组(P<0.01)；仔鼠肠道中的sIgA含量，染毒组极显著高于对照组(P<0.01)(图3)。

图3 分娩后5 d和15 d对照组与染毒组小鼠各组织的LPS和sIgA含量

2.3 内毒素对母鼠生殖激素水平的影响

分娩后5 d，血清中E2和P4的含量，对照组与染毒组差异不显著(P>0.05)；血清中的LH含量，对照组显著高于染毒组(P<0.05)；血清中的FSH含量，对照组显著高于染毒组(P<0.05)。分娩后15 d，血清中E2和P4的含量，对照组与染毒组差异不显著(P>0.05)；血清中的LH含量，对照组显著高于染毒组(P<0.05)；血清中的FSH含量，对照组显著高于染毒组(P<0.05)(图4)。

A.分娩5 d和15 d后E2含量；B.分娩5 d和15 d后P4含量；C.分娩5 d和15 d后LH含量；D.分娩5 d和15 d后FSH含量

3 讨论

内毒素干预雌性小鼠会使卵母细胞和胚胎发育产生不良影响[1]。本试验发现对照组仔鼠出生后5 d和15 d对照组存活率显著高于染毒组。分娩后5 d，染毒组仔鼠存活率差和仔鼠呈弱胎。内毒素进入小鼠体内后，蓄积在肠道中，当一定量时突破肠道屏障，进入循环系统。随着血液的循环卵泡发育受到影响，卵子排出困难，受孕率下降。内毒素的免疫刺激下，所产生的免疫应答在某些方面也会改变机体的代谢，饲料利用率下降[2]。内毒素作用下小鼠的采食量下降、饲料利用率下降，间接导致小鼠繁殖性能下降[3]。本试验通过ELISA检测雌性小鼠在分娩后5 d和15 d的生殖激素水平，染毒组的E2含量和P4含量相较于对照组无显著差异，而FSH与LH的含量显著高于对照组。生殖激素促进生殖器官的发育成熟，包括卵子的产生、排出、精子的产生、受精、着床、妊娠及泌乳等一系列生殖过程。LPS对卵巢颗粒细胞具有增促作用，而E2和P4与卵巢颗粒细胞关系非常密切，颗粒细胞会分泌雌激素，然后促进雌性动物发情和卵泡生长，形成黄体后能够分泌孕激素，维持妊娠[4]。LPS会通过下丘脑-垂体-性腺轴，使正常的激素调控发生紊乱，影响性腺功能，同时抑制E2、FSH、LH的分泌，促进P4分泌。50 μg/mL的LPS浓度下能促进雌激素的合成和分泌[5]。本研究注射0.3 mL的1 mg/kg LPS溶液产生的影响，结果与相关研究有部分差异，其中是否是剂量的原因有待进一步探究。

仔鼠的回肠中，染毒组LPS的含量极显著高于对照组，说明胚胎在子宫中发育时受到了内毒素的影响。分娩后5 d，雌性小鼠的结肠和回肠中LPS含量都高于对照组，表明内毒素进入机体后，会在肠道内蓄积，当肠道内毒素蓄积过多就会突破肠道屏障，进入循环系统。分娩后15 d，母鼠子宫中的LPS含量升高，这是由于内毒素已经穿过肠道屏障侵入到其他的组织器官中蓄积到了子宫中[6]。内毒素入侵机体直接影响到免疫系统，所以sIgA的变化与LPS的含量有关。胎儿在子宫内发育成熟离开母体后，便暴露于存在着许多抗原的环境中。胎儿出生后，必须从母体那里获得被动免疫(即免疫球蛋白)，在本试验中，分娩后5 d，染毒组结肠、回肠、仔鼠肠道sIgA的含量高于对照组，在回肠和仔鼠肠道差异极显著；分娩后15 d，sIgA的含量呈下降趋势；雌性小鼠的子宫中，sIgA从分娩后5 d到15 d呈现上升的趋势。结合LPS含量的变化，可能是因为肠道内的LPS含量减少，使机体免疫应答正在逐渐减弱，肠黏膜中主要的免疫球蛋白-肠黏膜第一道防线的sIgA含量也随之降低[7-9]。进而也可以推断，仔鼠肠道内的sIgA大多是从胎盘传递而来，后期的哺乳会传递一部分免疫球蛋白，子宫中内毒素含量越来越高，也就导致了子宫的sIgA含量逐步升高。

综上所述，给小鼠注射0.3 mL的1 mg/kg的LPS溶液时，会使小鼠采食量和体重下降，出现难产，产出弱胎、死胎、畸形胎等，严重影响了小鼠的繁殖性能。此外，sIgA的浓度随着LPS含量的变化而改变，当LPS含量高时，sIgA的含量也有一定的升高(激活了免疫应答)，间接的影响了小鼠的繁殖性能。其中染毒组FSH与LH的含量分泌紊乱进一步加剧繁殖性能的降低。但LPS如何致小鼠繁殖性能降低的发病机理还有待进一步深入研究。