张 宁，丁培阳，任东娜，陈艺兰，李雪洋，常泽杰，李青梅，张改平*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.河南省农业科学院动物免疫学重点实验室，河南郑州 450002；3.郑州大学生命科学学院，河南郑州 450001；4.河南农业大学动物医学院，河南郑州 450046)

非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的非洲猪瘟(ASF)具有高发病率和高病死率的特征[1]。家猪和野猪均为易感动物，软蜱可作为自然宿主和传播途径[2]。2018年我国首次暴发ASF，对我国养猪业造成严重打击[3]。非洲猪瘟病毒(ASFV)属非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)、非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)[4]。ASFV是一种巨大且复杂的正20面体病毒，直径约260 nm，具有独特的5层复杂结构，包括外膜、衣壳、双层内膜、核心壳层和基因组[5-6]。H240R蛋白是位于ASFV衣壳顶点上的一个五聚体结构，有研究表明该蛋白对ASFV 20面体衣壳的形成至关重要[7-8]。研究制备出ASFV H240R蛋白多克隆抗体，但H240R抗体是否具有中和作用还有待进一步研究[9]。本试验对ASFV H240R基因进行原核表达，成功制备出针对H240R蛋白的单克隆抗体，旨在为下一步鉴定H240R蛋白抗原表位提供材料，有利于深入了解该蛋白的结构与功能。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级6周龄～8周龄Balb/c雌鼠5只，购自郑州大学实验动物中心。

1.1.2 主要试剂 异丙基-β-D-硫代半乳糖甘(IPTG)、1640培养基，北京索莱宝生物科技有限公司产品；胎牛血清(FBS)，北京全式金生物技术有限公司产品；HRP标记羊抗鼠IgG、超敏ECL化学发光试剂盒，碧云天生物技术有限公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HAT、HT等，Sigma公司产品。

1.1.3 仪器设备 PCR仪，德国耶拿分析仪器股份有限公司生产；恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司生产；恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司生产；离心机，美国赛默飞公司生产；核酸电泳仪，美国伯乐公司生产；CO2培养箱，日本三洋公司生产；-80冰箱，长虹美菱股份有限公司生产。

1.2 方法

1.2.1 表达菌株的构建 根据NCBI GenBank公布的ASFV流行株DB/LN/2018 H240R基因序列(GenBank：MK333181.1)进行大肠埃希氏菌密码子优化，设计上、下游引物H240R-F和H240R-R，分别在上、下游引物5′端引入NdeⅠ和XhoⅠ限制性酶切位点(下划线部分)，H240R-F序列：GGGAATCCATATGGCGGCGAACATC，H240R-R序列：CCCGCTCGAGGCTACCACCTTTGCTGGTTTTCAGAG，由上海生工生物工程有限公司合成。以H240R质粒DNA为模板，进行PCR扩增，回收后的PCR产物和pET-29b载体用NdeⅠ和XhoⅠ限制性内切酶双酶切后连接。转化至Trans5α感受态细胞，经菌液PCR鉴定筛选阳性重组质粒后送由上海生工生物工程有限公司测序，将测序正确的重组质粒命名为pET-29b-H240R。

1.2.2 pET-29b-H240R重组质粒的表达与纯化 将pET-29b-H240R重组质粒和pET-29 b空载体分别转化至BL21(DE3)感受态细胞，于LB/K+培养基，37℃过夜培养；将菌液转接后培养至OD600nm值为0.6～0.8时加入终浓度为0.2 mmol/L IPTG，16℃、160 r/min诱导表达18 h。收集菌体，超声破碎，SDS-PAGE分析蛋白表达情况。H240R重组蛋白表达成功后，扩大培养，收集破碎菌体上清，用镍柱进行初步纯化，再用凝胶过滤预装柱Superdex 200 Increase 10/300 GL进一步纯化，SDS-PAGE分析蛋白纯度，并分别以ASFV阳性血清和抗His-tag鼠单克隆抗体为一抗进行Western blot鉴定。

1.2.3 检测H240R蛋白的间接ELISA方法 纯化后的H240R重组蛋白用pH 9.6碳酸盐缓冲液(CBS)稀释至1 mg/L，100 μL/孔包被于酶标板，4℃过夜孵育；PBST洗涤3次，50 g/L脱脂奶粉37℃封闭2 h；PBST洗涤3次，将稀释后的样品加到包被有抗原的酶标板，并设置阴性对照，37℃孵育1 h；PBST洗涤3次，加入1∶1 000 HRP标记山羊抗小鼠IgG，100 μL/孔，37℃孵育1 h；PBST洗涤3次，100 μL/孔四甲基联苯胺(TMB)避光显色12 min，2 mol/L H2SO4终止反应；酶标仪测定OD450nm吸光度值，阴性对照OD450nm值<0.2时，试验成立。

1.2.4 免疫小鼠及血清抗体效价的测定 将6周龄Balb/c小鼠采用皮下多点注射方法按常规免疫程序进行免疫，共免疫4次，间隔21 d，免疫剂量为10 μg/只，间接ELISA方法检测小鼠血清抗体效价，选1只抗体效价最高的小鼠进行融合，融合前3 d腹腔注射重组蛋白H240R 10 μg。

1.2.5 细胞融合及单克隆抗体的筛选 常规方法进行细胞融合[10]。9 d～12 d用间接ELISA方法对杂交瘤细胞上清进行检测，并用本实验室前期用大肠埃希氏菌体系表达的PCV2 Cap蛋白作为反筛抗原[11]，肉眼判断颜色变化，筛选出抗H240R蛋白阳性孔，抗PCV2 Cap蛋白阴性孔的杂交瘤细胞。通过有限稀释法进行3次亚克隆，直至杂交瘤细胞上清阳性率为100%。

1.2.6 腹水的制备 取6周龄～12周龄Balb/c小鼠，腹腔注射500 μL高压灭菌石蜡，7 d后小鼠腹腔注射2×106～5×106个杂交瘤细胞。1周后可观察到小鼠腹腔明显变大，用9#针头采集腹水。将收集到的腹水10 000 r/min离心10 min后收集上清液。

1.2.7 单克隆抗体腹水效价的测定 参考1.2.3步骤间接ELISA法检测单克隆抗体效价。当P/N(单抗OD450nm值/阴性对照OD450nm值)≥2.1，判为阳性；P/N<2.1，判为阴性；以阳性孔对应样品最高稀释度，作为单抗效价。

1.2.8 单克隆抗体亚型鉴定 按照武汉华美生物小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒说明书操作，鉴定单抗亚型。

1.2.9 Western blot鉴定单克隆抗体特异性 将纯化后的H240R重组蛋白经SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜上，50 g/L脱脂奶粉封闭，以杂交瘤细胞培养上清为一抗，HRP标记羊抗鼠IgG为二抗，ECL发光成像系统显色。

1.2.10 Dot blot鉴定单克隆抗体特异性 取1 μL重组蛋白H240R点至硝酸纤维素(NC)膜，用PCV2 Cap蛋白作阴性对照。待NC膜干燥后，用50 g/L脱脂奶粉于4℃过夜封闭；以单克隆抗体细胞上清为一抗，室温孵育1 h；PBST洗涤3次，以HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，室温孵育1 h；PBST洗涤3次，用ECL试剂在化学成像仪中曝膜。

1.2.11 间接免疫荧光试验反应性鉴定 参照ASFV流行株DB/LN/2018 H240R基因序列，将H240R基因进行人源偏嗜性密码子优化，送上海生工生物工程有限公司合成。构建PCAGGS-HA-H240R表达载体，转染至HEK-293T细胞，用HA标签的羊抗鼠单抗进行Wesrern blot鉴定蛋白表达情况。将HEK293T细胞铺至12孔板，约12 h后，当细胞密度达70%～80%进行转染。36 h后收样，用提前预冷的甲醇固定，进行免疫荧光试验。以杂交瘤细胞培养上清为一抗，37℃孵育1 h；Alexa-Fluor-488山羊抗小鼠IgG为荧光二抗，37℃孵育1 h；DAPI染色液染细胞核5 min，在显微镜下观察，拍照保存。

2 结果

2.1 H240R重组蛋白的表达与纯化

2.1.1 重组质粒pET-29b-H240R的构建 H240R基因PCR扩增后，大小约723 bp，与预期大小一致(图1)。对构建好的重组子进行菌液PCR鉴定，凝胶电泳结果表明构建的载体中含有H240R蛋白基因(图2)，测序结果进一步证实了重组质粒构建成功。

M.DNA标准DL 2 000；1.H240R PCR产物M.DNA Maker DL 2 000；1.H240R PCR products

M.DNA标准DL 5 000；1.pET-29b-H240R；2.阴性对照

2.1.2 H240R重组蛋白的诱导表达 将阳性重组子菌液进行IPTG诱导表达，同时以未诱导和空载体作为阴性对照，SDS-PAGE结果表明诱导后的H240R蛋白上清和沉淀中均出现一大小约为27 ku的明显条带(图3)，与预期大小一致。

M.蛋白分子质量标准；1.诱导后的pET-29b空载全菌；2.未诱导的pET-29b-H240R全菌；3.诱导后的pET-29b-H240R菌体超声破碎液上清；4.诱导后的pET-29b-H240R菌体超声破碎液沉淀

2.1.3 重组蛋白的纯化及鉴定 重组蛋白H240R纯化后， SDS-PAGE 电泳检测，蛋白纯度约为90%(图4A)；Western blot鉴定H240R蛋白可与His标签鼠单克隆抗体和ASFV阳性血清反应，并出现两条特异性条带约在27 ku和63 ku下方(图4B、图4C)。通过串联质谱鉴定，确定了在63 ku下方出现的条带为H240R蛋白，说明H240R蛋白存在更高级的结构。

M.蛋白分子质量标准；1.纯化后的H240R蛋白；2.His标签鼠单克隆抗体检测H240R蛋白；3.ASFV阳性血清检测H240R蛋白

2.2 小鼠血清抗体效价测定

第4次免疫1周后用间接ELISA方法检测5只小鼠血清抗体效价，选择效价最高的4号小鼠进行融合，效价可达1∶12 800(图5)。

图5 H240R蛋白四免后小鼠血清效价检测

2.3 单克隆抗体生物学特性的鉴定

2.3.1 单克隆抗体效价的测定 用间接ELISA方法筛选并经过3次亚克隆后获得4株能够稳定分泌H240R蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为12D6、21G3、13D2、8G7。用这4株阳性杂交瘤细胞制备小鼠腹水，腹水效价均大于1∶40 000(图6)。

图6 单克隆抗体腹水效价的测定

2.3.2 H240R蛋白单克隆抗体亚类鉴定、Western blot鉴定和 Dot blot分析 将4株单克隆抗体进行亚型鉴定，结果显示12D6、21G3、8G7重链亚类为IgG2b，13D2重链亚类为IgG1，轻链亚类均为k。以4株单克隆抗体为一抗，进行Western blot鉴定，结果表明只有2株单克隆抗体21G3、13D2与变性的H240R重组蛋白发生较强反应(图7)；而12D6、8G7株单克隆抗体不能识别变性条件下的H240R蛋白。

将H240R重组蛋白点至NC膜上，PCV2 Cap蛋白作为阴性对照，以12D6、8G7株单克隆抗体细胞上清为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，检测单克隆抗体与H240R重组蛋白的反应性。结果显示，12D6、8G7株单克隆抗体与H240R重组蛋白反应良好(图8)。

图8 Dot blot鉴定单克隆抗体12D6 、8G7与H240R蛋白的反应性

2.3.3 单克隆抗体的IFA鉴定 将重组质粒PCAGGS-HA-H240R转染至HEK-293T细胞，Western blot鉴定蛋白表达情况。在约27 ku处出现一特异性条带(图9)，与目的条带大小一致，说明PCAGGS-HA-H240R质粒表达成功。以4株单克隆细胞培养上清为一抗进行IFA检测。4株单克隆抗体均出现荧光，而对照组无荧光信号(图10)，说明筛选到的单克隆抗体均能与真核表达的H240R蛋白反应。

M.蛋白分子质量标准；1.PCAGGS-HA空载体；2.PCAGGS-HA-H240R重组蛋白

图10 单克隆抗体的IFA鉴定

3 讨论

H240R蛋白是ASFV的一个次要衣壳蛋白，对ASFV组装至关重要。目前，关于该蛋白的抗原表位研究存在空白，而基于病毒蛋白的单克隆抗体是对蛋白进行基础与应用研究的重要生物材料。单克隆抗体作为疾病诊断的一个重要工具，已利用单克隆技术建立了一些ASFV检测方法，主要集中于p54和p30[12-13]，但关于H240R蛋白单克隆抗体方面的研究尚未见报道。

本试验构建了pET-29b-H240R重组质粒进行原核表达，通过镍亲和层析和凝胶过滤层析两步纯化得到纯度约为90%的重组蛋白H240R。对纯化后的蛋白经过质谱分析，发现H240R蛋白单体之间存在二硫键结构。Western blot鉴定结果表明，重组蛋白H240R有良好的反应原性。本试验共制备出4株针对ASFV H240R蛋白的单克隆抗体，腹水效价均高于1∶40 000，最高的一株效价为1∶1 280 000。4株单克隆抗体亚型分别为IgG2b和IgG1，轻链亚型均为κ。对4株单克隆抗体进行Western blot、Dot blot及IFA鉴定，发现均可与H240R蛋白特异性结合。且21G3、13D2株单抗能与变性的H240R重组蛋白发生反应，而12D6、8G7株单抗不能鉴定出变性条件下的H240R蛋白。因此,得出12D6、8G7株单克隆抗体识别的表位为线性表位，而21G3和13D2识别的是构象表位，这将为ASFV H240R蛋白结构、功能研究以及抗原表位的分析和精确定位起到了促进作用。