李 斌, 何 菱

(四川大学 华西药学院,四川 成都 610041)

近十年来,文献报道的七元杂环分子中,有近55%的生物活性表现在抗肿瘤方面[1-14](Chart 1),由此可知,七元氮杂环结构是一种潜在的抗肿瘤生物活性的结构单元。2013年,Olivier等[10]报道了具有破坏BET特定结构域(BRD2, BRD3和BRD4)功能的强效苯并二氮类抑制剂的构效关系,其中I-BET762(Chart 1)已进行白血病、淋巴瘤、脑瘤和骨髓瘤等多种癌症的临床试验工作。基于此,开展该类衍生物的合成和活性研究具有重要的现实意义。

Chart 1

本文为简化结构,从渗透性和不可逆结合方面改善抗肿瘤活性,以简单邻硝基苯甲酸衍生物为底物,经3或4步反应,并在第3步关环反应中用乙酰丙酮钼和三氟甲磺酸铜作为催化剂,最终合成了10个新型七元氮杂环1,4-苯并二氮杂-5-酮三氟乙基和环丙基取代衍生物(4a～4f,5a～5b,6a～6b, Scheme 1),其结构经1H NMR,13C NMR和HR-MS(ESI)表征。

Scheme 1

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Varian Mercury 400/600 MHz型核磁共振仪(DMSO-d6为溶剂,TMS为内标)；Bruker Daltonics Data analysis 3.2 mass spectrometer型质谱仪。

所用试剂均为分析纯。

1.2 合成(以化合物4a、 5b和6b为例)

(1) 化合物2a的合成

将邻硝基苯甲酸(501.00 mg, 3.00 mmol)置于干净无水的反应瓶中,氮气保护下向反应瓶中加入二氯亚砜(4.00 mL),并于80 ℃反应2 h。反应完全后,将多余二氯亚砜旋出,得到邻硝基苯甲酰氯。将三氟乙胺(0.26 mL, 3.30 mmol)置于另一装有搅拌子的干燥反应瓶内,氮气保护,无水操作下注入无水二氯甲烷(20.00 mL)和三乙胺(3.00 mL)。随后在冰浴条件下加入邻硝基苯甲酰氯,升至室温,反应10 h(TLC监测)。加入饱和碳酸氢钠溶液进行淬灭反应,用乙酸乙酯萃取,有机相用饱和食盐水洗涤,经硅胶柱层析(洗脱剂:石油醚/乙酸乙酯=1/1,V/V)纯化得白色固体2a690.00 mg,产率93%。

(2) 化合物3a的合成

将化合物2a(248.00 mg, 1.00 mmol)置于干燥的反应瓶中,注入干燥四氢呋喃(10.00 mL),氮气保护下进行无水操作。将反应瓶置于冰浴中,并向其中加入二异丙基氨基锂(LDA, ca. 2.00 M, 0.75 mL, 1.50 mmol),充分搅拌15 min。采用注射器缓慢滴加烯丙基溴化物(220.00 mg, 1.50 mmol)使其反应3 h, TLC监测至反应结束。之后向反应中加入饱和氯化铵溶液进行淬灭反应,用乙酸乙酯萃取,有机相用饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,减压旋蒸浓缩,得棕色油状液体3a,不经分离纯化,继续下一步反应。

(3) 化合物4a的合成

将化合物3a(31.60 mg, 0.10 mmol)置于装有搅拌子的反应管中,随后依次加入三苯基膦(75.00 mg, 0.29 mmol),乙酰丙酮钼(3.30 mg, 0.01 mmol),三氟甲烷磺酸酮(3.60 mg, 0.01 mmol),并注入干燥甲苯(3.00 mL)。将反应置于110 ℃的油浴锅中反应12 h，TLC监测至反应结束后,减压浓缩,经硅胶柱层析(洗脱剂:二氯甲烷/丙酮=70/1,V/V)纯化得白色油状液体三氟乙基取代的1,4-苯并二氮杂-5-酮4a10.00 mg。

(4) 化合物5b的合成

将化合物4d(30.00 mg, 0.12 mmol)置于装有搅拌子的反应管中,注入干燥的四氢呋喃(3.00 mL),氮气保护下进行无水操作。将反应瓶置于冰浴中,并向其中加入二异丙基氨基锂(LDA, ca. 2.00 M, 0.12 mL, 0.24 mmol),充分搅拌15 min。加入氨基磺酰氯(27.60 mg, 0.24 mmol),TLC监测至反应结束后,向反应中加入饱和氯化铵溶液进行淬灭反应,用乙酸乙酯萃取,有机相用饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,减压旋蒸浓缩,经硅胶柱层析(洗脱剂:石油醚/丙酮=4/1,V/V)纯化得黄色油状液体5b21.60 mg。

(5) 化合物6b的合成

将化合物4e(51.20 mg, 0.20 mmol)置于装有搅拌子的反应管中,并注入干燥的甲醇(2.00 mL)。之后将反应管置于-78 ℃,通入臭氧,反应1 min，再向其中加入二甲硫醚,搅拌下反应1 h。旋蒸除去二甲硫醚,残余物经硅胶柱层析(洗脱剂:石油醚/乙酸乙酯=2/1,V/V)纯化得白色油状液体6b23.00 mg。

2-(丙-1-烯-2-基)-4-(2,2,2-三氟乙基)-1,2,3,4-四氢-5H-苯并[e][1,4]二氮杂-5-酮(4a):白色油状液体,收率35%:1H NMR(400 MHz, Methanol-d4)δ: 7.60(d,J=7.8 Hz, 1H), 7.26(t,J=7.1 Hz, 1H), 6.84(d,J=8.2 Hz, 1H), 6.79(t,J=7.5 Hz, 1H), 5.10(s, 1H), 4.97(s, 1H), 4.70～4.54(m, 1H), 4.26(dd,J=7.8 Hz, 2.1 Hz, 1H), 3.99～3.86(m, 1H), 3.79(dd,J=15.3 Hz, 8.1 Hz, 1H), 3.59(dd,J=15.3 Hz, 2.7 Hz, 1H), 1.79(s, 3H);13C NMR(101 MHz, Methanol-d4)δ: 171.94, 146.06, 145.31, 132.74, 131.17, 124.73(q,J=280.0 Hz), 120.00, 119.12, 118.18, 112.28, 64.61, 50.28, 48.02(q,J=33.6 Hz), 17.95; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C14H16N2OF3{[M-H]-}285.1209 found 285.1211。

8-氟-2-(丙-1-烯-2-基)-4-(2,2,2-三氟乙基)-1,2,3,4-四氢-5H-苯并[e][1,4]二氮杂-5-酮(4b):淡黄色油状液体,收率42%;1H NMR(400 MHz, Methanol-d4)δ: 7.67(dd,J=8.7 Hz, 6.9 Hz, 1H), 6.55(dd,J=11.2 Hz, 2.2 Hz, 1H), 6.49(td,J=8.8 Hz, 8.4 Hz, 2.4 Hz, 1H), 5.08(s, 1H), 4.99(s, 1H), 4.71～4.49(m, 1H), 4.24(dd,J=8.1 Hz, 2.0 Hz, 1H), 3.99～3.87(m, 2H), 3.82(dd,J=15.3 Hz, 7.9 Hz, 1H), 3.62(dd,J=15.4 Hz, 2.5 Hz, 1H), 1.80(s, 3H);13C NMR(101 MHz, Methanol-d4)δ: 170.86, 165.89(d,J=248.9 Hz), 148.33(d,J=11.8 Hz), 144.76, 134.49(d,J=11.1 Hz), 124.72(q,J=280.0 Hz), 115.40(d,J=1.9 Hz), 112.55, 105.21(d,J=22.8 Hz), 103.92(d,J=24.4 Hz), 64.13, 50.39, 48.22(q,J=33.5 Hz), 17.85; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C14H15N2OF4{[M-H]-}303.1115 found 303.1116。

9-甲基-2-(丙-1-烯-2-基)-4-(2,2,2-三氟乙基)-1,2,3,4-四氢-5H-苯并[e][1,4]二氮杂-5-酮(4c):白色油状液体,收率33%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.39(d,J=7.2 Hz, 1H), 7.20(d,J=6.9 Hz, 1H), 6.67(t,J=7.5 Hz, 1H), 5.06(s, 1H), 4.98(s, 1H), 4.92(s, 1H), 4.76～4.58(m, 1H), 4.24(dd,J=10.7 Hz, 2.6 Hz, 1H), 4.09～3.92(m, 1H), 3.72(dd,J=15.3 Hz, 8.3 Hz, 1H), 3.54(dd,J=15.2 Hz, 2.3 Hz, 1H), 2.18(s, 3H), 1.74(s, 3H);13C NMR(101 MHz, DMSO-d6)δ: 170.75, 145.92, 143.64, 133.90, 130.27, 126.17,125.38(q,J=282.1 Hz), 121.57, 118.05, 112.94, 64.01, 50.18, 48.14(q,J=32.7 Hz), 19.62, 18.84; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C15H18N2OF3{[M-H]-}299.1366 found 299.1365。

4-环丙基-8-氟-2-(丙-1-烯-2-基)-1,2,3,4-四氢-5H-苯并[e][1,4]二氮杂-5-酮(4d):白色油状液体,收率32%;1H NMR(400 MHz, Methanol-d4)δ: 7.64(t,J=7.7 Hz, 1H), 6.62～6.31(m, 2H), 5.09(s, 1H), 4.97(s, 1H), 4.13(m, 1H), 3.68(dd,J=14.9 Hz, 7.2 Hz, 1H), 3.57(dd,J=15.2 Hz, 2.2 Hz, 1H), 2.91～2.79(m, 1H), 1.81(s, 3H), 0.98～0.86(m, 1H), 0.86～0.75(m, 2H), 0.74～0.65(m, 1H);13C NMR(101 MHz, Methanol-d4)δ: 172.11, 165.55(d,J=248.1 Hz), 148.21(d,J=11.6 Hz), 145.09, 133.87(d,J=11.0 Hz), 117.12(d,J=2.0 Hz), 112.09, 105.03(d,J=22.6 Hz), 103.79(d,J=24.3 Hz), 65.46, 50.17, 31.71, 18.13, 7.79, 5.12; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C15H18N2OF{[M-H]-}261.1398 found 261.1397。

4-环丙基-9-甲基-2-(丙-1-烯-2-基)-1,2,3,4-四氢-5H-苯并[e][1,4]二氮杂-5-酮(4e):淡黄色油状液体,收率36%;1H NMR(400 MHz, Methanol-d4)δ: 7.42(d,J=7.7 Hz, 1H), 7.20(d,J=7.1 Hz, 1H), 6.72(t,J=7.5 Hz, 1H), 5.14(s, 1H), 4.98(s, 1H), 4.37～4.10(m, 1H), 3.68(dd,J=15.0 Hz, 6.9 Hz, 1H), 3.53(dd,J=14.7 Hz, 3.2 Hz, 1H), 2.97～2.76(m, 1H), 2.21(s, 3H), 1.81(s, 3H), 0.97～0.87(m, 1H), 0.86～0.75(m, 2H), 0.75～0.63(m, 1H);13C NMR(151 MHz, Methanol-d4)δ: 173.54, 145.51, 143.27, 133.14, 128.76, 125.49, 122.78, 118.16, 111.95, 65.64, 49.73, 31.38, 18.26, 16.89, 7.63, 5.22; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C16H21N2O{[M-H]-}257.1648 found 257.1648。

4-环丙基-2-(丙-1-烯-2-基)-1,2,3,4-四氢-5H-苯并[e][1,4]二氮杂-5-酮(4f):淡黄色油状液体,收率35%;1H NMR(400 MHz, Chloroform-d)δ: 7.78(d,J=7.8 Hz, 1H), 7.24(t,J=6.9 Hz, 1H), 6.89(t,J=7.5 Hz, 1H), 6.68(d,J=7.7 Hz, 1H), 5.12(s, 1H), 4.96(s, 1H), 4.09(dd,J=8.0 Hz, 3.0 Hz, 1H), 3.57(dd,J=14.9 Hz, 8.2 Hz, 1H), 3.46(dd,J=14.9 Hz, 3.4 Hz, 1H), 3.06～2.77(m, 1H), 1.78(s, 3H), 1.01～0.89(m, 1H), 0.87～0.67(m, 3H);13C NMR(101 MHz, Chloroform-d)δ: 171.49, 145.34, 139.25, 132.30, 131.77, 123.63, 119.96, 119.29, 113.17, 66.63, 50.30, 31.45, 19.49, 8.03, 6.04; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C15H19N2O{[M-H]-}243.1492 found 243.1497。

4-环丙基-5-氧代-2-(丙-1-烯-2-基)-2,3,4,5-四氢-1H-苯并[e][1,4]二氮杂-1-磺酰胺(5a):黄色油状液体,收率70%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.81(d,J=7.8 Hz, 1H), 7.27(t,J=7.1 Hz, 1H), 7.16(d,J=6.3 Hz, 1H), 6.93(s, 2H), 6.90(d,J=8.3 Hz, 1H), 6.69(t,J=7.4 Hz, 1H), 6.10(s, 1H), 4.12～3.96(m, 1H), 3.28～3.07(m, 2H), 2.28～2.18(m, 1H), 2.01(s, 3H), 0.57～0.46(m, 1H), 0.42～0.15(m, 3H);13C NMR(101 MHz, DMSO-d6)δ: 188.45, 152.92, 148.01, 134.31, 131.00, 130.68, 120.99, 120.31, 117.47, 57.56, 50.10, 33.07, 24.74, 8.30, 6.93; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C15H19N3O3SNa{[M-Na]-}344.1039, found 344.1044。

4-环丙基-8-氟-5-氧基-2-(丙-1-烯-2-基)-2,3,4,5-四氢-1H-苯并[e][1,4]二氮杂-1-磺酰胺(5b):黄色油状液体,收率55.4%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.88(t,J=8.0 Hz, 1H), 7.42(d,J=6.1 Hz), 6.94(s, 2H), 6.68(d,J=11.6 Hz, 1H), 6.54(t,J=8.3 Hz, 1H), 6.10(s, 1H), 4.13～3.98(m, 1H), 3.26～3.02(m, 2H), 2.36～2.13(m, 1H), 2.01(s, 3H), 0.68～0.48(m, 1H), 0.46～0.11(m, 3H);13C NMR(101 MHz, DMSO-d6)δ: 187.26, 166.16(d,J=249.4 Hz), 152.67, 149.99(d,J=12.6 Hz), 134.29(d,J=11.4 Hz), 130.86, 118.34(d,J=0.7 Hz), 105.95(d,J=23.0 Hz), 104.60(d,J=23.9 Hz), 57.60, 50.28, 33.02, 24.73, 8.34, 6.89; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C15H18N3O3FSNa{[M-Na]-}362.0945 found 362.0946。

2-乙酰基-4-环丙基-3,4-二氢-5H-苯并[e][1,4]二氮杂-5-酮(6a):白色油状液体,收率60%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.92(d,J=7.8 Hz, 1H), 7.67(t,J=7.6 Hz, 1H), 7.49(t,J=7.4 Hz, 1H), 7.44(d,J=7.9 Hz, 1H), 3.90(s, 2H), 2.98～2.82(m, 1H), 2.53(s, 3H), 0.83～0.75(m, 2H), 0.75～0.67(m, 2H);13C NMR(101 MHz, DMSO-d6)δ: 198.03, 167.60, 165.08, 144.80, 132.17, 131.12, 128.85, 128.52, 127.55, 41.23, 31.69, 25.01, 7.38; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C14H14N2O2Na{[M-Na]-}265.0948 found 265.0948。

2-乙酰基-4-环丙基-9-甲基-3,4-二氢-5H-苯并[e][1,4]二氮杂-5-酮(6b):白色油状液体,收率45%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.72(d,J=7.8 Hz, 1H), 7.52(d,J=7.3 Hz, 1H), 7.36(t,J=7.7 Hz, 1H), 3.87(s, 2H), 2.97～2.77(m, 1H), 2.55(s, 3H), 2.40(s, 3H), 0.82～0.64(m, 4H);13C NMR(101 MHz, DMSO-d6)δ: 198.04, 167.75, 163.39, 143.23, 134.93, 133.13, 128.82, 128.67, 128.17, 41.14, 31.66, 25.03, 18.47, 7.36; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C15H17N2O2{[M-H]-}257.1285 found 257.1278。

1.3 抗肿瘤活性实验方法

乳腺癌细胞系MDA-MB-231等在含有10%胎牛血清,42 mmol·L-1谷氨酰胺,1 mmol·L-1丙酮酸钠,100 μg·mL-1链霉素,100 μg·mL-1青霉素和0.25 μg·mL-1两性霉素的5%二氧化碳DMEM培养基中常规培养,培养温度为37 ℃。肿瘤细胞被接种在含有10%胎牛血清的DMED培养基的24孔板培养板上,接种密度为每孔2×104个。将细胞以苯并二氮杂产物在0.01～1.00 mmol·L-1之间的5种剂量浓度下培养5 d。使用相同体积的二甲基亚砜作为空白对照,以苯达莫司汀(Bendamustiune,双功能烷化剂)和伏立诺他(SAHA, HDAC抑制剂)作为阳性药物对照,采用细胞数与细胞活力分析仪计数。以药物处理过的细胞存活数除以空白对照细胞存活数计算细胞存活百分比。

2 结果与讨论

2.1 抗肿瘤活性

本研究分别选取了人乳腺癌细胞MDA-MB-231,非小细胞肺癌细胞A549,宫颈癌细胞HeLa和慢性骨髓性白血病细胞K562进行体外抗肿瘤测试,实验结果如表1所示。从表1中可知,化合物对4种肿瘤细胞均有一定抑制作用,其中4a的活性较突出,三氟乙基的引入使得该类化合物对K562细胞具有良好的活性,IC50值可达2.6 μM。此外,4a对A549和MDA-MB-231肿瘤细胞也有较好的抑制作用,但是对Hela细胞的抑制效果不佳。6a和6b的测试结果显示,经臭氧化反应衍生获得α,β-不饱和酮衍生物,使得化合物对K562细胞的活性提高,IC50值均低于10 μM。由5a的的抑制活性可知,磺酰胺基的引入,使得化合物对肿瘤的抑制作用有所增强,但可能因溶解性原因效果仍不理想,因而需进一步优化。苯并二氮杂化合物中引入三氟乙基和环丙基等不同基团,以及在苯环上甲基氟代对MDA-MB-231, A549, HeLa和K562均有不同程度影响。因此,揭示该类化合物的抗肿瘤活性具有重要研究意义。

表1 抗肿瘤活性试验结果Table 1 Antitumor activities of the compounds

3 结论

本研究经3步或4步反应,并且在第3步关环反应中使用乙酰丙酮钼和三氟甲磺酸铜作为催化剂共合成了10个未见文献报道的苯并二氮杂酮三氟乙基和环丙基取代衍生物。首先以取代的邻硝基苯甲酰胺衍生物为底物,在乙酰丙酮钼和三氟甲烷磺酸铜的催化下,三苯基膦作还原剂,通过硝基还原、双键重排、氮宾插入过程完成了七元杂环化合物的构建。此外,对人乳腺癌细胞MDA-MB-231、非小细胞肺癌细胞A549、宫颈癌细胞HeLa和慢性骨髓性白血病细胞K562 4种细胞株的体外抗肿瘤活性进行了测定。其中,三氟乙基的引入使得该类化合物对K562的活性IC50值达2.6 μM,表明三氟乙基和环丙基修饰的七元环对抗肿瘤活性有一定的影响。同时,经臭氧化反应衍生获得的α,β-不饱和酮衍生物使得化合物对K562细胞的活性IC50值达4.9 μM。经抗肿瘤活性初步探索,有望改善和提高该类衍生物的抗肿瘤活性,为进一步研究肿瘤活性提供参考。