叶贺贺 卢 涛 钟 婧 董佳敏 李梦佳 李 珂 吴 莹

（北京中医药大学生命科学学院，北京 102488）

流感是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，主要通过空气中含流感病毒的气溶胶进行传播［1］。流感是人类面临的主要公共卫生问题，据WHO 统计，流感病毒平均每年导致300~500 万人感染重症，30~50万人死亡［2］。流感感染存在复杂的免疫病理。流感病毒主要感染呼吸道上皮细胞，在上皮细胞中复制，可引起上皮细胞凋亡、坏死；同时，病毒成分被上皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、肺微血管内皮细胞等免疫细胞的模式识别受体（PRRs）识别，活化免疫细胞，产生IFNs、TNF-α、IL-1β、CCL2等细胞因子，启动机体抗流感免疫应答［3］。不充分的抗病毒免疫应答导致病毒大量复制，而过度免疫应答也导致免疫病理反应，因此，病毒、宿主、免疫应答间的平衡决定了流感的结局。其中，病毒与宿主细胞以及免疫细胞间的相互作用一直是感染免疫领域研究热点。

外泌体是一种由多种细胞分泌的含多种遗传物质和信号分子的膜性囊泡，大小为30~150 nm，可在细胞间传递蛋白、mRNA 和miRNA，是细胞间通讯的关键递质［4］。外泌体可通过多种机制与靶细胞相互作用，而外泌体携带的miRNA 是其发挥作用的重要原因［5］。研究表明，病毒可改变被感染细胞分泌的外泌体miRNA 表达，差异表达的miRNA 对靶细胞进行修饰或改变，为病毒复制和传播创造有利条件［6-7］。目前流感病毒感染中对外泌体的研究较少。本研究对流感病毒感染A549 细胞分泌的外泌体进行提取、鉴定，通过RNAseq 检测外泌体携带的差异miRNA，对差异miRNA进行靶基因预测、分析，以期进一步研究流感病毒感染上皮细胞外泌体miRNA的免疫功能。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 狗肾细胞株MDCK 购于北京协和基础医学院细胞库；人肺癌基底上皮细胞株A549由北京中医药大学生命科学学院医学整合中心实验室所惠赠。

1.1.2 流感病毒株 甲型流感病毒鼠肺适应株PR8（A/PR8/34）由中国预防医学科学院病毒学研究所提供，本实验室-80 ℃保存。

1.1.3 试剂 DMEM 培养基（Hyclone 公司）；DMSO、双抗青链霉素、胰蛋白酶（Trypsin，Gibco 公司）；胎牛血清（ABW 公司）；RIPA 裂解液（Thermo 公司）；ECL 超敏显色液（上海碧云天生物技术有限公司）；外泌体磁珠提取试剂盒（美天旎公司）；流感病毒核蛋白NP 抗体（北京义翘神舟公司）；Hsp70、calnexin、CD63 和 CD9 单 克 隆 抗 体（Santa Cruz公司）；β-actin、488标记的羊抗鼠IgG（H+L）、山羊封闭血清、山羊抗小鼠、山羊抗兔抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 流感病毒扩增 选取9 日龄SPF 级鸡胚，在胚胎对侧气室线0.5 cm 处避开大血管标记进针部位，无菌钻蛋器对准进针位置钻开约2 mm 小孔，无菌注射器吸取0.2 ml PR8 垂直经小孔注入鸡胚，棉签蘸取融化的石蜡封口。将鸡胚倾斜45°于37 ℃培养48 h，每隔8 h 翻转1 次鸡胚。-20 ℃竖直保存1 h后转移至4 ℃冰箱过夜，收取鸡胚尿囊液待用。HA检测鸡胚尿囊液中PR8 血凝效价，选取血凝效价高或接近的鸡胚尿囊液混匀，分装，-80 ℃保存待用。

1.2.2 A549、MDCK 细胞培养 从-80 ℃冰箱取出细胞株，快速放入37 ℃水浴锅中解冻，移至含2 ml DMEM 培养基的离心管中，4 ℃、1 000 r/min 离心5 min，弃上清，加入2 ml 培养基，混匀，转移至含5 ml 培养基的T25 培养瓶，十字形混匀后37 ℃、5%CO2培养。待细胞生长至单层80%~90%融合，弃细胞培养液，PBS 洗涤2 次，加入1 ml 0.25%胰酶消化，当细胞变圆脱落时，加入完全培养基终止消化。一部分细胞悬液转移至离心管，4 ℃、1 000 r/min 离心5 min，弃上清，加入1 ml细胞冻存液混匀，转移至细胞冻存管冻存；另一部分细胞悬液分装于其他细胞培养瓶进行传代培养，传代2~3 次后加入96 孔细胞培养板用于病毒感染性测定试验。

1.2.3 流感病毒株PR8 半数细胞培养物感染量（TCID50）测定 病毒组用DMEM 培养基对PR8 进行连续10 倍递次稀释，将各稀释度的病毒液接种于MDCK细胞单层吸附的96孔板，对照组仅加稀释液。置于37 ℃、5%CO2培养箱中吸附2 h，弃病毒液改用细胞维持液继续培养，孵育24 h、48 h、72 h 后倒置显微镜下观察细胞病变效应（cytopathogenic effect，CPE），记录病变程度和孔数。以对照组为参照，病毒感染细胞出现变圆、坏死、从瓶壁脱落的病变率达50%以上的细胞孔为病变孔，Reed-Muench 法计算病毒TCID50。

1.2.4 间接免疫荧光检测PR8对A549细胞的感染率 取对数生长期A549 细胞，调整细胞浓度为5×105个/ml，接种于6孔板（0.1 ml/孔），37 ℃、5%CO2培养，待细胞完全贴壁后，病毒组用100 μl PR8稀释液（100 TCID50）感染细胞，对照组仅加稀释液，2 h后弃上清，更换为无血清完全培养基，48 h 后终止培养。选取其中3 个孔分别加入1 ml 胰酶消化后计数，铺于 6 孔板。PBS 浸洗 5 min×3 次，多聚甲醛固定15 min，PBS 浸洗3 min×3次，0.3%Triton X-100室温通透 10 min，PBS 浸洗 3 min×3 次，吸水纸吸干PBS，滴加山羊血清室温封闭1 h，加入NP 抗体4 ℃孵育过夜，加入488标记的羊抗鼠IgG（H+L）二抗孵育1 h，PBS浸洗3 min×3次，滴加DAPI避光孵育5 min，PBST 洗涤5 min×4 次，含抗荧光淬灭剂的封片液封片，荧光显微镜下观察。

1.2.5 外泌体提取 A549细胞培养方法同1.2.4，终止培养后收集细胞上清，4 ℃、2 000 g 离心30 min，收集上清。采用超速离心法提取外泌体，4 ℃、300 g 离心 10 min，取上清，4 ℃、2 000 g 离心10 min，取上清，4 ℃、10 000 g离心10 min，取上清经0.22 μm 滤膜过滤转移至超高速离心管，4 ℃、110 000 g 离心75 min，弃上清，收集管底沉淀，10 ml PBS 重悬，4 ℃、110 000 g 离心 75 min，PBS 重悬沉淀，分装并标记病毒组为PR8-exos，对照组为Conexos。采用免疫磁珠法纯化外泌体，按照试剂盒说明书将超速离心所得的PR8-exos与CD9磁珠、CD63磁珠、CD81磁珠共孵育1 h，加至μMACS 分选柱，用100 μl 分离缓冲液洗涤 3 次，将 μMACS 分选柱移出磁场，洗脱得到纯化的外泌体。

1.2.6 电镜观察外泌体的形态和粒径大小 取10 μl 外泌体重悬液置于载样200 目铜网，室温静置5 min，用滤纸从侧面吸干液体，取10 μl 3%磷钨酸滴加于铜网，室温复染5 min，吸干磷钨酸，将铜网置于65 ℃白炽灯下烘干10~15 min，80 kV 条件下采用透射电镜观察。

1.2.7 纳米粒径分析（NTA）检测外泌体的粒径分布 将外泌体用 PBS 稀释，0.22 μm 滤膜过滤，取3 ml 悬液用可视化纳米颗粒示踪分析仪Zetaview PMX 110 进行粒径分析，设置参数为激光器488 nm、25 ℃、pH=7.2、导电性敏感度90%、快门数70、光亮强度70、模式11 point、拍照模式middle。纳米粒度分析仪检测外泌体粒径分布情况。

1.2.8 Western blot 检测外泌体标志蛋白表达分 别 取 PR8-exos、Con-exos、A549 细 胞 裂 解 液 和100 TCTD50的 PR8 稀释液，RIPA 裂解液裂解后加入4×SDS上样缓冲液，95 ℃水浴变性10 min，取等量蛋白进行SDS-PAGE 电泳，冰上转膜，5%脱脂奶粉封闭 1 h，TBST 洗膜 3 次，分别加入 β-actin、calnexin、Hsp70、CD63、CD9 抗体 37 ℃孵育 2 h，TBST 洗涤3 次，加入对应二抗37 ℃孵育 1 h，PBS 洗涤3 次，加入超敏型ECL显色液曝光并保存图片。

1.2.9 外泌体RNA 提取 向PR8-exos 和Con-exos重悬液中各加入700 μl QIAzol，漩涡振荡10 s，简短离心后室温孵育 5 min，加入 140 μl 氯仿/异戊醇（24∶1）混匀，室温孵育2~3 min。4 ℃、12 000 g 离心8 min，取上清，加入2 倍上清体积的无水乙醇，混匀，过柱纯化，加入 700 μl RWT 缓冲液洗 1 次，加入500 μl PE 缓冲液洗 2 次，12 000 g 离心 2 min，甩干膜，弃收集管，将柱子移至新的收集管，加入20 μl去RNA酶水，室温孵育1 min，12 000 g离心2 min，洗脱RNA，得到约15 μl洗脱产物。

1.2.10 RNAseq 构建文库，取RNA 样品，用聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离回收Small RNA。配制3'接头的连接体系，70 ℃ 2 min，25 ℃ 2 h；加入反转录引物，65 ℃ 15 min，以0.3 ℃/s降温至4 ℃；配制并加入5'接头连接体系，70 ℃ 2 min，25 ℃ 1 h。进行反转录-PCR 扩增，回收产物，保存于EB 缓冲液。采用安捷伦2100 生物分析仪检测浓度与文库长度。变性打开双链PCR 产物，加入环化引物，使PCR 单链成环状。通过联合探针锚定聚合技术进行测序，鉴定PR8-exos 和Con-exos 中差异表达的miRNA，进行差异表达分析和生物学功能KEGG和GO富集分析。

2 结果

2.1 流感病毒株PR8 感染MDCK、A549 细胞 观察 PR8 对 MDCK 细胞的 CPE，Reed-Muench 法计算其TCID50为10-4.12/0.1 ml。与对照组相比，100 TCID50PR8 感染后的A549 细胞胞质中均可观察到明显绿色荧光。通过对比白光和荧光下细胞数，100 TCID50的PR8对A549细胞感染率为100%，同时未观察到A549细胞出现空泡、变圆等CPE（图1）。

图1 间接免疫荧光法检测PR8对A549细胞的感染率Fig.1 Infection rate of PR8 on A549 cells detected by indirect immunofluorescence assay

2.2 外泌体形态与粒径大小 电镜观察囊泡形态和大小可对Con-exos和PR8-exos进行初步鉴定，拍摄视野中Con-exos 和PR8-exos 直径多为50~150 nm，但大小不完全一致；小囊泡形态均为杯托状小囊泡，是典型的圆形双层膜小囊泡结构（图2）。

图2 透射电镜观察外泌体形态和大小（100 nm/200 nm）Fig.2 Morphology and size of exosomes observed by transmission electron microscopy（100 nm/200 nm）

2.3 外泌体粒径分布 NTA 检测发现大部分囊泡粒径为100 nm，PR8-exos 和Con-exos 粒径大小分布几乎一致（图3）。50%Con-exos 粒径分布在100 nm左右，另外50%Con-exos的粒径分布在170 nm左右，100%PR8-exos 的粒径分布在 150 nm 以下（表 1）。PR8-exos 浓度高于Con-exos 浓度，说明流感病毒可刺激细胞外泌体产生（表2）。

图3 NTA检测外泌体粒径分布及浓度Fig.3 Particle size distribution and concentration of exosomes detected by NTA

表1 Con-exos与PR8-exos粒径分布（nm）Tab.1 Particle size distribution of Con-exos and PR8-exos（nm）

表2 Con-exos与PR8-exos浓度（Particles/ml）Tab.2 Concentrations of Con-exos and PR8-exos（Particles/ml）

2.4 外泌体表面分子标志物表达 Western blot 检测表明不同来源外泌体和细胞裂解液，26、27 和70 kD 处均可检测到目的条带，说明提取的外泌体携带CD63、CD9 和Hsp70 蛋白。同时正常细胞裂解液中检测到calnexin，外泌体中却均未检测到。PR8病毒液中均未检测到CD63、CD9、Hsp70 和calnexin（图4）。

图4 Western blot鉴定外泌体表面分子标志物Fig.4 Molecular markers on surface of exosomes identified by Western blot

2.5 Con-exos 和PR8-exos 差异表达miRNA 凝胶成像系统和紫外分光光度计检测显示，Con-exos 总RNA 浓度为 0.292 0 ng/μl，PR8-exos 总 RNA 浓度为0.364 0 ng/μl，均满足建库实验要求。将样本与miRBase 数据库进行比对，共检测到238 个已知miRNA，VENN 图分析发现，Con-exos 携带 190 个miRNA，PR8-exos 携带 183 个，共 135 个，Con-exos 特有55 个，PR8-exos 特有 48 个（图5）。筛选得到差异表达 miRNA 共 84 个，与 Con-exos 组相比，PR8-exos组表达下调的43 个，表达上调的41 个。将筛选出的差异miRNA 的基因表达量进行聚类分析，发现两组差异基因呈3 种表达模式聚类（图6），也说明PR8-exos 和Con-exos 在基因转录和表达水平上存在明显差异。PR8-exos 组特有的差异表达miRNA 共27个，Con-exos组特有的差异表达miRNA共3个。

图5 Con-exos和PR8-exos miRNA韦恩图Fig.5 miRNA VENN diagrams of Con-exos and PR8-exos

图6 Con-exos和PR8-exos组差异miRNA表达变化聚类图Fig.6 Cluster diagram of changes in differential miRNA expression in Con-exos group and PR8-exos group

2.6 差异miRNA 的KEGG 和GO 富集分析 对Con-exos 和 PR8-exos 筛选出的差异 miRNA 进行靶基因预测，84 个差异miRNA 共预测到579 个靶基因mRNA。对其靶基因mRNA 进行GO 富集分析，发现对应的靶基因主要富集于有丝分裂细胞周期的G1/S转换、细胞周期、蛋白质稳定、细胞对DNA 损伤刺激的反应、转录的正调控、DNA 模板、RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录负调控、细胞增殖的负调节、RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录、RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录正调控、细胞增殖、转录的负调控、DNA 模板、凋亡过程的负调控、凋亡过程的正调控、细胞分裂、细胞增殖的积极调节、凋亡过程、基因表达的正调节、蛋白质磷酸化、病毒过程、蛋白质泛素化、细胞内信号转导、转录、DNA 模板、转录调节、DNA 模板、RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录调控、信号转导等生物过程（图7），表明差异表达的miRNA 可能在这些过程调控中发挥作用。对差异miRNA靶基因进行KEGG富集分析（图8），表明差异miRNA 调控的靶基因主要涉及细胞增殖和凋亡、固有免疫及炎症反应、干扰素相关信号通路。与细胞增殖、凋亡调控相关的差异miRNA有36个，PR8-exos 中表达上调的有 18 个，下调的有 18 个，靶基因主要集中于p53信号通路、前列腺癌、叉头蛋白O（FoxO）信号通路、AMPK 信号通路、调节干细胞多能性的信号通路、缺氧诱导因子（HIF-1）信号通路、细胞周期、乙型肝炎、神经营养蛋白信号通路、肺癌蛋白多糖、磷脂酰肌醇-3 激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路、肿瘤通路、胰岛素信号通路、癌症中的 microRNAs、麻疹、Hippo 信号通路、黏着斑、癌症转录调控、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、小G 蛋白Rap 信号通路、Ras 信号通路、病毒致癌通路、内质网中蛋白质加工、人类嗜T淋巴细胞病毒感染、肌动蛋白细胞骨架的调节等信号通路。与固有免疫及炎症反应相关的差异miRNA 有64 个，PR8-exos 中表达上调的31 个，下调的33 个，调控的靶基因主要集中于MyD88、IL-10、Jak-STAT、CAMKⅡ、SOCS 和 NLRP 等信号通路。与 Con-exos 相比，PR8-exos 差异miRNA 调控的与干扰素信号通路有关的靶基因有41个，调控这些靶基因的miRNA 有66个，其中表达上调的30 个，表达下调的36 个。相关靶基因涉及IFN 基因（IFNL1、IFNA2、IFNA8、IFNB1）、IFN 受体基因（IFNAR1、IFNLR1）、干扰素刺激基因（MX2、IRF9、CCL11）、JAK-STAT通路（JAK2、STAT2）。结果见附录表（www.immune99.com）。

图7 Con-exos 和 PR8-exos 组差异 miRNA 靶基因 GO 富集分析Fig.7 Go enrichment analysis of differential miRNA target genes in Con-exos and PR8-exos groups

图8 Con-exos 和 PR8-exos 组差异 miRNA 靶基因 KEGG富集分析Fig.8 KEGG enrichment analysis of differential miRNA target genes in Con-exos and PR8-exos groups

3 讨论

外泌体可携带miRNAs 影响靶细胞功能，在病毒复制、感染免疫中发挥重要作用。研究表明，外泌体与靶细胞融合后，外泌体传递的病毒和细胞miRNAs 可通过抑制 mRNA 翻译改变基因表达［8］。EB病毒感染的细胞外泌体富含EBER、LMP1和EB病毒BART miRNA，可通过外泌体转移至邻近或远隔未感染细胞，激活AKT和ERK信号通路，从而维持病毒持续潜伏感染与肿瘤形成［9-10］。MAEMURA 等［11］研究发现，流感病毒感染小鼠后，可促进肺组织外泌体分泌，小鼠支气管肺泡灌洗液中差异miRNAs明显升高，其中miR-483-3p 升高显著，可调节Ⅰ型IFN 和促炎细胞因子产生，在抗病毒及炎症反应中发挥重要作用，同时也在高致病性H5N1 禽流感病毒感染的小鼠血清中发现外泌体囊泡中miR-483-3p显著增加，可增强促炎细胞因子基因在血管内皮细胞中的表达［12］。MAEMURA 等［11］研究表明，小鼠流感病毒感染模型中肺泡灌洗液及血浆中的外泌体miRNAs 成分在流感感染免疫中发挥重要作用。研究流感病毒感染细胞外泌体携带的差异miRNAs 及其功能有助于深入了解流感感染中的病毒与宿主以及免疫细胞间的相互作用。

目前对流感病毒感染细胞外泌体的研究仍较少，因此，本文首先对流感病毒PR8 感染A549 细胞后分泌的外泌体（PR8-exos）及正常A549 细胞分泌的外泌体（Con-exos）进行提取和鉴定。由于外泌体与病毒形态、大小极为相似，课题组采用超速离心法结合CD9、CD81、CD63 磁珠免疫法对外泌体进行提取分离。通过100 000 g 超速离心收集产物，可能包含了囊泡与病毒的混合物，但外泌体标志蛋白有CD9、CD63 和CD81 等，而病毒表面一般无这些标志蛋白表达，因此可通过CD9、CD81和CD63免疫磁珠吸附纯化外泌体［13］。

透射电镜观察发现纯化的外泌体形态为圆盘杯托状小囊泡，符合文献报道的外泌体典型形态。NTA 检测结果提示 PR8-exos 浓度高于 Con-exos，说明流感病毒感染可刺激外泌体分泌［13］，与MAEMURA等［11］在流感病毒感染小鼠模型中观察到的结果一致。

Western blot 进一步鉴定了外泌体的蛋白标志物。根据国际囊泡协会要求，采用蛋白标志物鉴定外泌体时应选择3 个阳性指标、1 个阴性指标，阳性指标包括跨膜蛋白（如四次跨膜蛋白CD63、CD9等）、细胞内源性蛋白，如肿瘤易感基因101（tumor susceptibility gene 101，TSG101）、膜联蛋白A（Annexin A，ANXA）、Rab 家族蛋白 Rab 及热休克蛋白（如Hsp70、Hsp90 等），而不存在的1 个阴性指标有内质网来源蛋白，如钙连接蛋白（calnexin，CANX）、高尔基体基质蛋白（golgi matrix protein，GM130）或核蛋白［14］。Western blot 对 PR8-exos、Con-exos 鉴定的结果均符合国际囊泡协会制定的3个阳性、1个阴性的标准，证实所提取的囊泡为外泌体，而正常细胞细胞裂解液中检测到的calnexin 外泌体中均未检测到，PR8 病毒裂解液中也未检测到CD63、CD9、Hsp70和calnexin。

miRNAs 也是外泌体囊泡携带的主要成分，外泌体通过转移miRNAs 影响靶细胞功能，是外泌体主要的作用方式之一。miRNAs 是基因调控网络中的核心成员，在流感感染免疫中发挥重要的调控作用。研究报道，在病毒感染中，外泌体包含的miRNAs 如hsa-miR-92a、hsa-miR-320c、hsa-miR-30e 表达上调可能会调控病毒基因片段，影响病毒感染［15］。目前，关于流感病毒感染细胞外泌体miRNAs 的报道较少。毛立［16］报道了外泌体和自噬在山羊副流感病毒3型（CPIV3）感染中的作用，发现CPIV3感染可促进细胞分泌外泌体，CPIV3 外泌体（CPIV3-exo）对miRNA有明显的选择性，可携带miRNA参与调控细胞自噬相关通路，抑制IFN-α 和oasl 的表达。在MAEMURA 等［11］对流感病毒感染小鼠肺泡灌洗液中差异miRNA表达谱的研究中，miR-16-5p等miRNA发生明显变化，本课题组提取的流感病毒感染A549细胞分泌的外泌体中也检测到miR-16-5p 的差异表达。MAEMURA 等［11］主要研究了肺泡灌洗液中显著差异表达的miR-483-3p，发现其可调控IFN-β，调节病毒感染后的固有免疫应答，但PR8-exos 中并未检测到miR-483-3p 的差异表达，可能是由于不同病毒毒株感染，以及不同种属的组织、细胞来源的外泌体中差异miRNA 的表达谱不同。PR8-exos 中差异miRNA 调控的靶基因主要涉及细胞增殖凋亡、固有免疫与炎症反应、IFN 相关的信号通路等。本研究为进一步探讨流感病毒感染A549 细胞外泌体miRNA在流感病毒感染免疫中的作用奠定了基础。