蒋昌华 （重庆市涪陵中心医院，重庆 408000）

百草枯是目前世界上使用最为广泛的除草剂，人误食后主要作用于肺［1］。晚期肺纤维化导致的呼吸衰竭是百草枯主要致死原因［2］。我国作为农业大国，百草枯应用广泛，目前，虽然百草枯已属禁止药物，但因其在农业上应用效果显著，个别地区仍有使用，中毒病例数一直居高不下，由于救治技术进展缓慢，病死率位居第一［3-5］。为探索新的救治方法，提高百草枯中毒治疗成功率以及改善患者预后，本研究建立百草枯急性中毒家兔模型，探究环磷酰胺联合甲强龙的治疗效果，观察其对家兔肺组织氧化应激损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 50 只8~10 月龄家兔，平均年龄（9.1±0.7）个月，体质量3 000~3 990 g，平均体质量（3 465.2±362.8）g，由维通利华动物技术公司提供。于30%~35%相对湿度、（23.8±1.5）℃环境中喂养1周，光照12 h/d。本研究经重庆市涪陵中心医院伦理委员会批准。

1.1.2 主要试剂 20%百草枯溶液购于南京杜邦生物化工公司；SOD、MDA 测试盒及HE 染色试剂盒购于南京建成生物工程研究所；家兔血清TGF-β1及PⅢP测试盒购于上海史瑞可生物科技有限公司；兔抗大鼠TNF-α、TIMP-1 ELISA 试剂盒购于美国R＆D公司。

1.2 方法

1.2.1 建模 参考靳妍等［6］百草枯中毒小鼠建模标准进行建模，50 只家兔随机分为阴性对照组、百草枯组、甲强龙组、环磷酰胺组、联合治疗组，每组10 只。对各组家兔进行麻醉处理，去除背部体毛，固定，消毒，建模在无菌环境中进行。家兔实验前禁食不禁水12 h，百草枯组、甲强龙组、环磷酰胺组及联合治疗组腹腔注射20%百草枯溶液，12 h后，甲强龙组腹腔注射甲强龙（60 mg/kg），环磷酰胺组腹腔注射环磷酰胺（50 mg/kg），联合治疗组腹腔注射甲强龙（60 mg/kg）及环磷酰胺（50 mg/kg），以10%生理盐水溶解，阴性对照组注射等量生理盐水。观察各组家兔行为及肺外观变化。

1.2.2 血清采集 于1 d、2 d、3 d、4 d 对家兔耳缘进行静脉采血。将家兔固定于固定箱内，剪除耳缘静脉局部被毛，乙醇消毒，手指轻弹兔耳使其静脉充盈扩张，左手拇指按压家兔近心端，右手将针头刺入耳缘静脉使血液流出。血样放置于促凝真空管，2 h 内 3 000 r/min 离心，静置 5 min，取出血清样本，冷冻保存。

1.2.3 标本采集 取血完成后对家兔进行空气栓塞处死，立即开胸，分离肺组织送检。送检前将肺组织固定于4%甲醛溶液完全浸泡，24 h后行常规石蜡包埋及连续切片，组织学光镜检测，切片前进行HE染色。

1.2.4 HE 染色 烤干切片，脱蜡处理，顺序置于梯度浓度乙醇中复水3 min。苏木精染色15 min，清洗3次，盐酸-乙醇分化处理30 s，充分清洗，1%伊红染色，乙醇脱水，脱蜡，封片，显微镜下观察。

1.2.5 RT-PCR 检测 TNF-α mRNA、TIMP-1 mRNA表达 提取细胞总RNA，检测RNA纯度、含量，逆转录获得cDNA，设计引物序列，所得RNA 以逆转录试剂盒逆转录为cDNA，荧光定量PCR 仪扩增，反应条件：95 ℃预变性 90 s；5 ℃变性 10 s，60 ℃退火 30 s，共40 个循环。扩增反应结束后，65 ℃缓慢加热至95 ℃，建立 PCR 产物熔解曲线，2-ΔΔCt法计算，采用Primer Premier 6.0 软件设计 PCR 引物，由 Invitrogen公司合成引物。

1.2.6 ELISA 检测TGF-β1、HYP、PⅢP、NE 水平处死大鼠，收集外周血，30 min 内以1 500 r/min 离心20 min，取上清，-80 ℃保存待测。按试剂盒说明书检测TNF-α、TIMP-1蛋白及TGF-β1、PⅢP、NE水平，采用50 mm 碳酸盐包缓冲液稀释抗原，加入聚苯乙烯反应孔，加盖，4 ℃放置24 h，次日洗涤3次，干燥，0.1 ml/孔加入稀释的待测标本，并加入阳性和阴性对照，42 ℃放置60 min，移除液体，洗涤3 次，干燥，0.1 ml/孔加入TNF-α、TIMP-1蛋白及TGF-β1、PⅢP、NE抗体，放置60 min，移除液体，洗涤3次，抛干，加入底物液混匀，加入0.1 ml邻苯二胺遮光反应20 min，0.05 ml/孔加入2 mol/L H2SO4终止反应。

1.2.7 黄嘌呤氧化酶法检测SOD 水平 取聚苯乙烯试管，分为测量管、对照管。提取样品，于上清中加入10倍体积的蒸馏水，配制为1%溶液。测量管、对照管内均加入1.0 ml 试剂盒试剂，测量管加入样品50 μl，对照管内加50 μl蒸馏水，放入旋涡混匀器充分混匀，37 ℃恒温水浴40 min。显色：对照管、测量管中各加2 ml 显色剂，室温放置10 min。采用蒸馏水调零分光光度法计算（波长550 nm，1 cm光径）。

1.2.8 MDA 检测 取聚苯乙烯试管，分为标准管、标准空白管及测量管、测量空白管，标准管中加入10 nmol/L 四乙氧基丙烷0.1 ml 与试剂盒试剂，标准空白管加0.1 ml无水乙醇与试剂，测量管加入0.1 ml肌肉组织匀浆上清与试剂盒试剂，测量空白管加0.1 ml 肌肉组织匀浆上清与试剂盒试剂，摇动试管架混匀，标准管、标准空白管、测量管置于3 ml 硫代巴比妥酸与1 ml 双蒸水，测量空白管置于硫代巴比妥酸3 ml 与50%冰乙酸1 ml。所有试管置于旋涡混匀器混匀，试管口采用保鲜薄膜扎紧，针头刺出1 个小孔，95 ℃水浴40 min，流水冷却，4 ℃、3 500~4 000 r/min 离心10 min，移液器吸取上清，加入比色皿内待检，蒸馏水调零分光光度法计算MDA值。

1.2.9 肺湿/干重比检测 取家兔右肺上叶，切除多余结缔组织，擦拭表面血液，天平称量，80 ℃烘烤48 h，称量，计算肺湿/干重比。

1.3 统计学分析 采用SPSS21.0软件进行统计学分析，计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HE 染色结果 阴性对照组家兔肺组织肺泡结构较为清晰，且肺泡壁薄，仅有少数红细胞。百草枯组家兔肺泡萎缩塌陷较为明显，且已出现大量纤维化改变。环磷酰胺组与甲强龙组家兔肺组织内纤维化缓解，联合治疗组纤维化明显缓解（图1）。

图1 各组家兔肺组织病理学变化Fig.1 Pathological changes of lung tissue of rabbits in each group

2.2 TNF-α、TIMP-1 mRNA 表达 如表 1 所示，与阴性对照组、甲强龙组、环磷酰胺组及联合组相比，百草枯组 TNF-α、TIMP-1 mRNA 表达升高，与阴性对照组相比，甲强龙组、环磷酰胺组及联合治疗组TNF-α、TIMP-1 mRNA 表达升高，与甲强龙组相比，环磷酰胺组及联合治疗组TNF-α、TIMP-1 mRNA 表达降低，且联合治疗组 TNF-α、TIMP-1 mRNA 表达低于环磷酰胺组（P＜0.05）。

表1 各组家兔肺组织 TNF-α、TIMP-1 mRNA 表达（，n=10）Tab.1 TNF-α and TIMP-1 mRNA expressions in lung tissue of rabbits in each group（，n=10）

表1 各组家兔肺组织 TNF-α、TIMP-1 mRNA 表达（，n=10）Tab.1 TNF-α and TIMP-1 mRNA expressions in lung tissue of rabbits in each group（，n=10）

Note：Compared with negative control group，1）P＜0.05；compared with paraquat group，2）P＜0.05；compared with methylprednisolone group，3）P＜0.05；compared with cyclophosphamide group，4）P＜0.05.

TIMP-1 mRNA 1.04±0.15 2.23±0.231）1.88±0.171）2）1.57±0.171）2）3）1.41±0.151）2）3）4）Groups Negative control Paraquat Methylprednisolone Cyclophosphamide Combined treatment TNF-α mRNA 1.12±0.19 2.45±0.261）1.83±0.181）2）1.65±0.161）2）3）1.31±0.131）2）3）4）

2.3 SOD 及 MDA 含量比较 建模 2 d、4 d 后，与阴性对照组、甲强龙组、环磷酰胺组及联合治疗组相比，百草枯组SOD含量降低、MDA 含量升高，与阴性对照组相比，甲强龙组、环磷酰胺组及联合治疗组SOD 含量降低、MDA 含量升高，与甲强龙组相比，环磷酰胺组及联合治疗组SOD含量升高、MDA 含量降低，且联合治疗组SOD 含量高于、MDA 含量低于环磷酰胺组（P＜0.05，表2）。

表2 各组血清SOD及MDA含量比较（，n=10）Tab.2 Comparison of serum SOD and MDA contents in each group（，n=10）

表2 各组血清SOD及MDA含量比较（，n=10）Tab.2 Comparison of serum SOD and MDA contents in each group（，n=10）

Note：Compared with negative control group，1）P＜0.05；compared with paraquat group，2）P＜0.05；compared with methylprednisolone group，3）P＜0.05；compared with cyclophosphamide group，4）P＜0.05.

Groups 4 d 4.21±0.31 10.68±0.751）8.83±0.581）2）7.12±0.421）2）3）6.15±0.371）2）3）4）SOD/（U·ml-1）2 d 269.53±16.24 203.36±10.211）221.57±11.561）2）231.57±12.361）2）3）252.63±14.471）2）3）4）4 d 272.36±18.34 146.25±11.271）164.25±10.791）2）195.31±11.791）2）3）212.15±12.641）2）3）4）Negative control Paraquat Methylprednisolone Cyclophosphamide Combined treatment MDA/（nmol·ml-1）2 d 5.16±0.29 9.95±0.421）8.69±0.351）2）6.75±0.421）2）3）5.41±0.421）2）3）4）

2.4 血清 TGF-β1、PⅢP 及 HYP 水平比较 建模2 d、4 d 后，与阴性对照组、甲强龙组、环磷酰胺组及联合治疗组相比，百草枯组TGF-β1、PⅢP及HYP 水平升高，与阴性对照组相比，甲强龙组、环磷酰胺组及联合治疗组TGF-β1、PⅢP及HYP 水平升高，与甲强龙组相比，环磷酰胺组及联合治疗组TGF-β1、PⅢP及 HYP 水平降低，且联合治疗组 TGF-β1、PⅢP 及HYP水平低于环磷酰胺组（P＜0.05，表3）。

表3 各组血清TGF-β1、PⅢP、HYP水平比较（，n=10）Tab.3 Comparison of serum levels of TGF-β1，PⅢP and HYP in each group（，n=10）

表3 各组血清TGF-β1、PⅢP、HYP水平比较（，n=10）Tab.3 Comparison of serum levels of TGF-β1，PⅢP and HYP in each group（，n=10）

Note：Compared with negative control group，1）P＜0.05；compared with paraquat group，2）P＜0.05；compared with methylprednisolone group，3）P＜0.05；compared with cyclophosphamide group，4）P＜0.05.

Groups 4 d 78.25±8.16 167.43±14.631）149.28±11.341）2）131.63±9.871）2）3）115.29±11.351）2）3）4）TGF-β1/（pg·ml-1）2 d 27.65±0.18 164.25±13.471）139.57±10.251）2）107.62±5.711）2）3）83.24±5.711）2）3）4）4 d 34.57±0.27 215.32±17.561）175.63±13.241）2）136.73±7.361）2）3）117.83±7.361）2）3）4）PⅢP/（ng·ml-1）2 d 7.13±0.58 29.16±2.171）23.56±2.251）2）20.28±2.141）2）3）15.29±1.271）2）3）4）4 d 7.94±0.09 42.67±4.591）37.41±3.271）2）19.87±1.181）2）3）16.59±1.581）2）3）4）Negative control Paraquat Methylprednisolone Cyclophosphamide Combined treatment HYP/（μg·lung-1）2 d 82.56±9.63 175.28±13.461）154.57±12.571）2）132.39±11.571）2）3）113.25±10.261）2）3）4）

2.5 NE 水平及肺上叶湿/干重比 与阴性对照组、甲强龙组、环磷酰胺组及联合治疗组相比，百草枯组NE 水平及肺上叶湿/干重比升高，与阴性对照组相比，甲强龙组、环磷酰胺组及联合治疗组NE 水平及肺上叶湿/干重比升高，与甲强龙组相比，环磷酰胺组及联合治疗组NE 水平及肺上叶湿/干重比降低，且联合治疗组NE 水平及肺上叶湿/干重比低于环磷酰胺组（P＜0.05，表4）。

表4 各组NE水平及肺上叶湿/干重比比较（，n=10）Tab.4 Comparison of wet/dry weight ratio of upper lobe and NE level in each group（，n=10）

表4 各组NE水平及肺上叶湿/干重比比较（，n=10）Tab.4 Comparison of wet/dry weight ratio of upper lobe and NE level in each group（，n=10）

Note：Compared with negative control group，1）P＜0.05；compared with paraquat group，2）P＜0.05；compared with methylprednisolone group，3）P＜0.05；compared with cyclophosphamide group，4）P＜0.05.

Wet/dry weight ratio/%3.59±0.12 9.86±0.791）8.71±0.371）2）6.16±0.211）2）3）4.32±0.411）2）3）4）Groups Negative control Paraquat Methylprednisolone Cyclophosphamide Combined treatment NE/（10-3 U·L-1）2.57±0.08 15.42±3.241）10.79±0.811）2）6.35±0.461）2）3）5.36±0.431）2）3）4）

3 讨论

百草枯对植物、人类、动物均有较强毒性，主要作用于肺，误食早期多出现急性肺损伤，晚期则发生肺纤维化，病死率高达60%~80%［7］。研究发现，腹腔注入百草枯构建大鼠模型，第1 天就会对肺组织造成严重损伤［8］。百草枯主要使体内生成氧自由基诱导脂质过氧化，从而导致组织细胞，尤其是肺组织出现氧化性损伤［9］。百草枯中毒后，肺部由于出现大量超氧阴离子自由基，引起较强烈的外源性氧化应激反应，导致肺组织细胞DNA 大量凋亡。甲强龙作为临床常用激素类药物，属于糖皮质激素，可缓解机体中毒，但副作用较多［10］。环磷酰胺属于烷化剂类免疫抑制剂，作为细胞毒性药物，能够杀死有丝分裂及进入循环周期的细胞，破坏内部DNA结构，阻断细胞复制，因此具有较强的免疫抑制作用［11］。研究表明，环磷酰胺可抑制动物体液免疫和细胞免疫，导致免疫抑制［12］。

早期急性肺炎与后期肺纤维化是百草枯中毒过程显著的病理改变，其中炎症细胞浸润及炎症因子释放具有重要作用。研究显示，百草枯导致肺纤维化过程的主要机制为炎症反应，炎症细胞因子水平在中毒过程中均升高［13］。其中 TNF-α 作为主要细胞因子参与肺损伤形成，在肺组织炎症反应中发挥重要作用，通过观察TNF-α 水平能够反映肺损伤过程中炎症反应严重程度。研究显示，急性百草枯中毒发展过程中，TIMP-1 水平升高，发展为肺间质纤维化中，与TIMP-1表达密切相关［14］。随着TNF-α、TIMP-1 细胞因子在肺纤维化发病及病理过程中的作用备受关注，本研究同时检测TNF-α、TIMP-1 mRNA 及 TNF-α、TIMP-1 蛋白水平，结果显示，环磷酰胺联合甲强龙治疗，TNF-α、TIMP-1 mRNA 及TNF-α、TIMP-1蛋白水平显著下降，说明二者联合治疗能够降低百草枯中毒过程中的炎症反应。

百草枯作用于机体后，会被肺泡细胞摄取，导致氧化还原反应中大量OFR 出现，机体处于氧化应激状态，从而释放炎症因子，细胞及线粒体钙稳态失衡，引发过氧化反应造成肺损伤［15］。SOD 作为机体内重要的自由基清除剂，MDA 作为脂质过氧化终产物之一，临床上常用于评价机体氧化损伤程度［16］。本研究显示，环磷酰胺联合甲强龙对急性百草枯中毒模型家兔进行治疗，SOD 下降程度与MDA上升程度较低，说明二者联合治疗可抑制氧化应激，缓解肺损伤。

研究认为TGF-β 是启动纤维化形成的枢纽，可诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，从而促进胶原合成、分泌，使成纤维细胞增殖数增加，从而导致纤维化［17］。其中 TGF-β1 作为重要的致纤维化因子，临床认为其是抗纤维化治疗理想靶点［18］。PⅢP是Ⅲ型前胶原转化成Ⅲ型胶原时释放的多肽，其水平出现增高说明组织纤维化开始，是早期肺纤维化诊断的有力评价指标［19］。本研究显示，环磷酰胺联合甲强龙治疗急性百草枯中毒模型家兔，TGF-β1、PⅢP及HYP水平降低，说明二者联合治疗可抑制肺纤维化形成。

NE是中性丝氨酸蛋白酶的一种，可分解钙黏连素，导致肺纤维网状支架塌陷及增加肺毛细血管膜通透性，血浆蛋白及活性物质较多地渗进肺间质、肺泡，导致机体非心源性肺水肿［20］。研究显示，NE是导致肺组织损伤、加重肺不张过程中重要的酶，因此，NE变化监测可预测肺组织损伤情况［21］。研究表明，肺组织中湿/干重比能够间接说明肺内漏出液体多少，漏出液体越多，肺湿/干重比越高，同时灌洗液回收率也随着增高［22］。本研究显示，环磷酰胺联合甲强龙治疗急性百草枯中毒模型家兔，NE水平及肺上叶湿/干重比降低，说明二者联合治疗可减轻肺组织损伤、肺不张及肺内漏液情况。

综上所述，环磷酰胺联合甲强龙治疗急性百草枯中毒模型家兔，可缓解急性百草枯中毒家兔炎症反应，抑制氧化应激及肺部纤维化形成，减轻肺组织损伤，同时缓解肺不张以及肺内漏液情况。