陈宏哲，孙长松，孙雅梅，徐丹丹，薛 华，陈 晓

肺癌是我国死亡率最高的恶性肿瘤，肺腺癌是 非小细胞肺癌中常见的病理类型， 发病年龄较小，在 发 病 早 期 即 可 发 生 血 行 转 移［1］。 环 状RNA（circRNAs） 是通过共价键形成的闭合环状非编码RNA［2］。 随着高通量测序技术及生物信息学技术的发展，越来越多的研究表明，circRNA 能够在表观遗传、转录以及转录后等多种水平上调控人体生理病理活动，调控肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移等生物学行为，影响肿瘤的生长、侵袭和转移［3-4］。 目前，关于肺腺癌circRNA 表达的研究多集中在肿瘤组织，其在外周血中的表达研究较少［5-7］。 环状闭合结构使circRNA 不会被核酸外切酶R 的消化，与线性RNA 相比在血液中有更高的稳定性， 在无创诊断领域具有很大应用价值。 因此，本研究选取文献报道较为集中的hsa_circ_0013958 和circHIPK3（hsa_circ_0000284），分析其在肺腺癌患者外周血中表达及表达水平与肿瘤侵袭、转移的关系［8-9］。

1 对象与方法

1.1对象 选取2019 年1 月～2021 年6 月于黑龙江省医院就诊的肺腺癌患161 例（肺腺癌组）。 所有患者均经病理确诊为肺腺癌； 未行放化疗等治疗。 排除肺癌复发或合并其他恶性肿瘤患者。 签署知情同意书后取样。 另于体检中心招募健康志愿者50 例（健康对照组），要求既往体健，无恶性肿瘤家族史。肺腺癌组男72 例、女89 例，年龄39 ～74 岁，健康对照组男22 例，女28 例，年龄40 ～69 岁。

1.2方法

1.2.1仪器与试剂 荧光定量PCR 仪为Thermo Fisher 生产，血液总RNA 提取试剂盒为天根生化科技（北京）有限公司生产，反转录试剂盒和荧光定量PCR 试剂盒为宝日医生物技术 （北京） 有限公司（TaKaRa 中国）提供。

1.2.2检测方法 肺腺癌患者于术前、健康对照组于知情同意后抗凝管采集外周静脉全血5 ml，离心后储存于－80 ℃冰箱待检。 手术肿瘤组织标本取出后放入RNA 固定剂中，-80 ℃冰箱保存。全血、肿瘤组织切片标本总RNA 提取按照试剂盒说明书操作，分光光度计测定RNA 的浓度及纯度，符合要求后进行反转录。 反转录反应条件：37℃，15 min，85℃，5 s，反应产物在扩增仪上扩增。定量PCR 内参基因为human GAPDH，hsa_circ_0013958 上游引物为GTTTGCTGGCTGGGCTTTTCC，下游引物为GGG ACCTCTAATAGCTGGGGGTTC；hsa_circ_0000284上游引物为TAGACTTTGGGTCGGCCAGT、 下游引物为TGGAATACACAACTGCTTGGC。 95℃预变性5 min，95℃变性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，30 个循环。 根据定量PCR 所得Ct 值，按照2-△Ct计算各样本的表达量。

1.3统计学处理 采用SPSS 25.0 软件包， 计量资料以（±s）表示，组间比较采用t检验，血液标本与肿瘤组织标本表达量的定量相关性分析采用Pearson 相关分析， 与分期等相关分析采用Spearman 秩相关，以ROC 曲线来评估两种circRNA对肿瘤良恶性的诊断价值。 以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1肺腺癌与健康对照组外周血circRNA 表达量比较 肺腺癌患者血液样本hsa_circ_0013958 表达量高于健康对照组，hsa_circ_0000284 表达量低于健康对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05，表1）。

表1 两组受检者外周血circRNA 表达量比较（± s）

表1 两组受检者外周血circRNA 表达量比较（± s）

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2.2肺腺癌患者血液及组织circRNA 表达量相关性 对43 例患者肺癌组织中hsa_circ_0013958 和hsa_circ_0000284 的表达进行检测， 与其血样表达量进行相关性分析显示，血液和肿瘤组织的表达量相关系数r 分别为0.823、0.785，均为高度正相关。

2.3外周血circRNA 表达与临床、病理特征相关性外周血hsa_circ_0013958 表达与肿瘤TNM 分期和淋巴结转移呈正相关， 相关系数r 为0.031、0.328，与性别、 年龄及肿瘤最大径无相关关系。hsa_circ_0000284 表达与肿瘤最大径、TNM 分期、淋巴结转移呈负相关，相关系数r 为-0.394、-0.362、-0.233，与性别、年龄不相关。

2.4外周血circRNA 诊断肿瘤良恶性价值 血液样本hsa_circ_0013958 诊断肺腺癌的ROC 曲线下面积为0.812，hsa_circ_0000284 的ROC 曲线下 面积为0.756。hsa_circ_0013958 以1.417 为截断值，诊断 敏 感 度 为 66.45% ， 特 异 度 为 96.00% 。hsa_circ_0000284 以-0.032 为截断值， 诊断敏感度为61.49%，特异度为98.00%。

3 讨论

circRNA 的发现丰富了人们对基因调控的认识，RNA 不仅是基因与蛋白之间的传递者， 也参与了基因转录后的调控。 circRNA 一个重要的功能就是通过内源性竞争性RNA （competing endogenous RNA，ceRNA） 途径发挥生物学作用， 不同蛋白的mRNA 通过竞争性结合同一种microRNA，调节相互的表达，互为ceRNA。 ceRNA 又称microRNA 海绵，可以通过结合多个microRNA 来抑制microRNA 对靶基因的作用［10］。如miR-7 的海绵体CDR1as，能与miR-7 结合抑制miR-7 的表达而间接达到抑瘤作用［11］。 此外，circRNA 还能与RNA 结合蛋白结合参与调控细胞增殖、分化、运动、凋亡和衰老等多种生物活动［12］。

除表达量高、稳定性强外，circRNA 通过外泌体广泛存在于组织液、血液、痰液中，取样简便且无创， 多在200 碱基以上的长度， 也便于进行定量PCR 检测，可突破传统线性mRNA 的局限性，有望成为恶性肿瘤早期诊断的最佳分子标志物之一［13］。在肺腺癌方面，circRNA 的研究尚在起步阶段。高通量测序已经在肺癌组织和细胞系中发现了大量cicrRNA， 但目前文献报道的肺腺癌表达谱差异有很大不同，Zhao 等［14］发现肺腺癌组织中共有357 个circRNA 失 调， 其 中hsa_circ_0404833、0406483、0006411、0401977、0001640 差异显著；Xiao 等［15］发现了148 个circRNA 显著变化，肺腺癌组织差异表达最显著的是hsa_circ_0007443、hsa_circ_0013093和hsa_circ_0003218。 本研究选择了在多种肿瘤组织中存在差异表达且丰度很高的hsa_circ_0000284以及表达上调的hsa_circ_0013958， 分析其在外周血中的表达。

本研究肺腺癌患者血液中hsa_circ_0013958、0000284 表达量与组织标本表达量呈高度正相关，说明检测血浆中circRNA 具有同样的意义。 进一步分析发现， 血液样本hsa_circ_0013958 表达水平与患者TNM 分期和淋巴转移均相关。 王西勇［16］报道，敲低hsa_circ_0013958 后， 裸鼠肿瘤组织免疫组织化学结果显示Ki67 的表达量明显减少，TUNEL 实验结果显示细胞凋亡的比例明显增加，证实了其具有抑制细胞凋亡的功能。 hsa_circ_0013958 促进肿瘤细胞增殖转移、 抑制细胞凋亡机制的研究结果从另一个角度佐证了本研究中血液表达量与分期和淋巴转移的相关性。 本研究中hsa_circ_0000284表达水平与肿瘤最大径、TNM 分期和淋巴转移负相关。 但是，通过查阅文献发现在不同肿瘤组织中hsa_circ_0000284 表达存在差异，如刘缝春［17］报道，Circ HIPK3（hsa_circ_0000284）在前列腺癌患者全血及组织中均高表达。 其机制及生物学功能尚待更多更深层次的研究。

综上， 肺腺癌患者外周血hsa_circ_0013958 和hsa_circ_0000284 的表达与健康者存在明显差异，其表达水平与肿瘤细胞增殖侵袭和转移相关，可能成为肺腺癌的潜在生物标记物。