苏静 赵隽 梁琼

上海中医药大学附属曙光医院肿瘤科，上海 200021

胶质瘤是源于中枢神经上皮的恶性肿瘤，占颅脑肿瘤的40%以上[1]。胶质瘤的治疗包括手术及放化疗等，但易复发和产生耐药性[2]。微RNA（microRNA，miRNA）-142-5p 编码基因位于17q22，转录后调控下游靶基因的表达[3]。研究表明，在多种肿瘤中miRNA-142-5p 异常表达，能够调控肿瘤细胞增殖、凋亡及转移等行为，促进肿瘤的发生、发展[4-5]。核糖蛋白2（ribophorin 2，RPN2）属于粗面内质网中Ⅰ型整合膜蛋白，参与分泌蛋白的转运，在肝癌、胃癌等肿瘤中能促进N-糖基化P-糖蛋白的糖基化并破坏其膜定位，促进肿瘤发生、发展[6-9]。本文通过研究miRNA-142-5p、RPN2 在脑胶质瘤中的表达，探讨两者的临床价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017 年1 月至12 月上海中医药大学附属曙光医院收治的85 例胶质瘤患者。纳入标准：①首次手术，术前无任何形式的肿瘤治疗；②经病理学检查确认为胶质瘤；③能够配合随访，资料完整。排除标准：①合并其他器官肿瘤；②罹患心肌梗死、脑卒中等急危重症疾病；③伴脑积水或脑部手术史。本研究经上海中医药大学附属曙光医院医学伦理委员会审核通过（20181211）。

1.2 研究方法

1.2.1 qRT-PCR 检测miRNA-142-5p、RPN2 mRNA 的表达 选取胶质瘤患者手术切除的癌组织及癌旁正常组织（距离癌组织>0.5 cm），应用Trizol 提取RNA，微量分光光度计检测RNA 的浓度和纯度。将RNA 反转录形成cDNA。qPCR 检测：miRNA-142-5p 正向引物序列：5’-GGCCCATAAAGTAGAAAGC-3’，反向引物序列：5’-TTTGGCACTAGCACATT-3’；U6 正向引物序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物序列：3’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-5’；RPN2 正 向引物序列：5’-CAAAGTCACCGGACAAGGTC-3’，反向引物序列：5’-TGGTGTTCCGAAGTTGGTCA-3’；GAPDH 正向引物序列：5’-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3’，反向引物序列：5’-TCAGCTCAGGGATGACCTTG-3’。qPCR 总体系20 μl：cDNA 模板1 μl，正反向引物各1 μl、SYBR Green 10 μl 及双蒸水7 μl。qPCR 条件：94℃预变性2 min，94℃变性15 s，62℃退火30 s，65℃延伸10 s，共35 个循环。2-ΔΔCt法表示miRNA-142-5p、RPN2 mRNA 的相对表达量。分别根据癌组织中miRNA-142-5p、RPN2 相对表达量的均值为界，分为高表达组和低表达组。

1.2.2 免疫印迹检测 组织研钵研磨，RIPA 裂解后BCA 法蛋白定量，进行免疫印迹检测。电泳后湿转法转膜。5%脱脂奶封闭2 h，一抗4℃孵育过夜（RPN2兔多克隆抗体购自Abcam，ab244399），山羊抗兔二抗室温孵育1 h。ECL 暗室显影照相，应用Image J 软件对蛋白条带的灰度值进行分析。

1.2.3 荧光素酶实验验证miRNA-142-5p 与RPN2的相互作用 pmiRNAGLO-RPN2-WT、pmiRNAGLORPN2-MUT 及miRNA-142-5p mimic 由华大公司设计合成。双荧光素酶测定系统（E1910，Promega，美国）和微板发光计（11300010，Berthold，德国）测定荧光素酶活性。将HEK293T 细胞以6×104细胞/孔密度接种到24 孔板，将pmiRNAGLO-RPN2-野生型（wild type，WT）或pmiRNAGLO-RPN2-突变型（mutant，MUT）报告基因分别与miRNA-142-5p mimic 共转染，分别作为RPN2 WT+miRNA-142-5p mimic 组和RPN2 MUT+miRNA-142-5p mimic 组。以单纯传染pmiRNAGLORPN2-WT 或pmiRNAGLO-RPN2-MUT 为RPN2 WT组和RPN2 MUT 组。转染48 h 后测定荧光素酶活性，并以海肾荧光素酶活性进行标准化。

1.2.4 随访 患者自病理确诊起进行随访，每个月电话随访1 次，随访的内容为患者生存及疾病进展情况，随访截止至随访结束（2020 年12 月）或患者死亡。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0 进行数据分析。计量资料用均数±标准差（）表示，组间比较采用t 检验。计数资料以例数表示。采用Kaplan-Meier 生存曲线法（logrank 检验）分析不同表达水平患者的3 年生在率。。相关检验为Pearson 相关分析。在线生物信息学软件Targetscan 预测miRNA-142-5p 与RPN2 的相互作用（http：//www.targetscan.org/mamm_31/）。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA-142-5p 及RPN2 的表达

miRNA-142-5p 在胶质瘤组织中的相对表达量低于癌旁正常组织[（0.612±0.137）和（1.679±0.286），t=31.021，P <0.001]，而RPN2 mRNA 在胶质瘤组织中的相对表达量高于癌旁正常组织[（1.833±0.314）和（0.412±0.047），t=41.263，P <0.001]。胶质瘤组织中RPN2 蛋白表达明显高于癌旁正常组织[（1.112±0.247）和（0.423±0.044），t=5.752，P <0.001]。

2.2 miRNA-142-5p 与RPN2 mRNA 的相关性及相互作用预测

相关性分析显示，miRNA-142-5p 与RPN2 mRNA表达呈负相关（r=-0.604，P ＜0.001）。RPN2 mRNA第596～621 碱基含有与miRNA-142-5p 互补结合位点。见图1A。与RPN2 WT 组及RPN2 MUT+miRNA-142-5p mimic 组 比 较，RPN2 WT+miRNA-142-5p mimic 组的荧光素酶活性降低（P ＜0.05）。见图1B。

图1 miRNA-142-5p 靶向抑制RPN2 基因表达

2.3 临床参数与miRNA-142-5p 和RPN2 mRNA 表达的关系

以癌组织中miRNA-142-5p 相对表达量的均值0.612 为界，分为高表达组42 例，低表达组43 例；以RPN2 的均值1.833 为界，分为高表达组41 例，低表达组44 例。不同卡氏功能状态（Karnofsky performance status，KPS）评分及世界卫生组织（World Health Organization，WHO）分级胶质瘤患者的miRNA-142-5p、RPN2 mRNA 表达比较，差异有统计学意义（P ＜0.05），不同年龄、性别、肿瘤直径、侵犯脑叶数的胶质瘤患者miRNA-142-5p、RPN2 mRNA 表达比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表1。

表1 临床参数与miRNA-142-5p 和RPN2 mRNA 表达的关系（例）

2.4 miRNA-142-5p 与RPN2 mRNA 表达对预后的影响

随访1～36 个月，无失访患者，死亡30 例。3 年总体生存率为64.7%（55/85），中位生存期为23.25（15.21，26.63）个月。miRNA-142-5p 低表达组中位生存期为18.21（14.21，25.63）个月，低于高表达组[26.10（19.34，33.15）个月]（log-rank χ2=9.247，P=0.038）。RPN2 高表达组患者中位生存期为19.30（15.07，26.21）个月，低于低表达组[25.60（17.19，32.54）个月]（log-rank χ2=8.226，P=0.010）。

3 讨论

胶质瘤是最常见的颅脑原发性恶性肿瘤，其发生、发展涉及复杂的分子机制。miRNA 是内源基因编码的长度为19～25 个核苷酸的单链RNA 分子，不仅在个体生长发育及凋亡等生理过程中发挥重要的作用，还参与心血管疾病、肿瘤等的病理学过程[10-13]。miRNA-142 基因位于17q22，能够编码产生具有发夹结构的miRNA-142-5p，在癌症、炎症、免疫失调等方面起着关键作用[14-17]。本研究发现癌组织中miRNA-142-5p的表达明显下调，且不同WHO 分级及KPS 评分患者miRNA-142-5p 表达不同，提示miRNA-142-5p 的低表达参与促进肿瘤的恶性进展。Li 等[18]研究发现，miRNA-142-5p 的表达受到长链非编码RNA LOXL1-AS1 的表达调控，LOXL1-AS1 能够结合并抑制miRNA-142-5p 的表达及功能，肿瘤发生时LOXL1-AS1的过度表达导致miRNA-142-5p 水平降低，下游癌基因PIK3CA 过度活化，导致肿瘤恶性增殖及转移。此外，miRNA-142-5p 低表达与患者不良生存预后有关。可能是因为胶质瘤中miRNA-142-5p 表达降低导致下游肿瘤干性基因Sema3C 的异常活化，并且导致胶质瘤患者的不良生存预后[19]。

RPN2 是高度保守的糖蛋白，位于粗糙内质网膜中，参与粗面内质网物质转运和结构维持[20]。RPN2 蛋白是寡糖基转移酶复合物的一部分，能将新生甘露糖寡糖与新生多肽链的NXST 共有基序中的天冬酰胺残基结合[21]。此外，研究显示，RPN2 基因敲低可以诱导结肠癌细胞凋亡并抑制迁移和侵袭[22]。本研究结果显示，癌组织中RPN2 mRNA 和蛋白表达水平升高，并且与WHO 分级及KPS 评分有关，提示RPN2 可能作为一种致癌基因，促进胶质瘤的疾病进展。研究显示，RPN2 通过介导表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）的糖基化，激活EGFR/ERK 信号通路的信号传导，进而促进肿瘤细胞恶性增殖，而RPN2 沉默通过EGFR 去糖基化降低了EGFR 向细胞表面的转运，抑制下游ERK 信号的传导[23]。此外，癌组织中RPN2 的高表达提示患者不良生存预后。可能是因为RPN2 能够促进多药耐药基因编码蛋白P-糖蛋白的糖基化，促进P-糖蛋白的膜定位，促进癌细胞对多西紫杉醇等化疗药物耐药性形成，导致患者预后不佳[24-25]。本研究显示miRNA-142-5p 与RPN2 在癌组织中呈负相关，同时，生信预测结果发现两者存在相互结合的位点，提示两者可能存在相互作用关系，荧光素酶报告基因实验进一步显示胶质瘤中RPN2受到miRNA-142-5p 的转录后表达调控。Ou 等[26]报道miRNA-142-5p 与RPN2 在肿瘤中能够共同调控EGFR 信号通路，两者的表达具有协同作用，共同促进肿瘤的恶性进展。

综上所述，胶质瘤中miRNA-142-5p 表达下调，而RPN2 表达上调，两者呈显著负相关，共同参与胶质瘤的恶性进展。