黄霞

宜宾市叙州区食品检验检测中心（宜宾 644699）

在国家标准GB/T 17204—2008[1]《饮料酒分类》中，保健酒属于配制酒（露酒），英文名字为blended alcoholic beverage类，其定义为：以发酵酒、蒸馏酒或食用酒精为酒基，加入可食用或药食两用的辅料或食品添加剂，进行调配、混合或再加工制成的，已改变了其原酒基风格的饮料酒。保健酒包括植物类配制酒、动物类配制酒、动植物类配制酒及其他类配制酒4大类。保健酒在中国的历史源远流长，具有调节机体的功能，以达到滋补养生、强身健体的作用[2]。它适用于特定人群食用，并不以治疗为目的，根据其功能，可分为补气、补血、滋阴、补阳和气血双补等类型，同时它必须具备有三种属性：即食品属性、功能属性、具有特定的功能、非药品属性[3]。一些不法商家为了吸引消费者以谋取暴利，随意添加短期内见效快、副作用大的化学药物，而且非法添加的药物剂量随意[4-5]，为消费者的健康埋下了隐患[6-10]。有关监管部门也投入了大量人力、物力打击非法添加的行为，但还是屡禁不止[11-14]，使通常起效慢的中药和保健食品似乎具备了速效、高效的优点[15]。所以在监管中采用高效、快速、准确的检测方法对这些非法添加的药物进行准确定性定量，以此作为这些非法活动的有力证据，对此类违法行为进行打击。此次研究就是采用液质联用的方法同时检测保健酒中的4种非法添加物质。

高效液相色谱（HPLC）是以液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。高效液相的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，因此应用范围广。近年来高效液相色谱法在药物分析中占主要地位，据《美国药典》22版记载，HPLC在含量测定方法中位居第一。

质谱（MS）是强有力的结构解析工具，能够为结构定性提供较多的信息，是理想的色谱检测器，不仅特异，而且具有极高的检测灵敏度。串联质谱法是质量分离的质谱检测技术，在单级质谱给出化合物相对分子量的信息后，对准分子离子进行多级裂解，进而获得丰富的化合物碎片信息，确认目标化合物，对目标化合物定量[15-17]。

液质联用即高效液相色谱串联质谱联用技术（highperformance liquid chromatography-mass spectrome-try，HPLC-MS/MS），它将液相色谱和质谱连接，把色谱的分离能力与高分辨质谱的高选择性、高灵敏度和高定性能力相结合，适合复杂成分、痕量物质的分析，并能提供分子量和结构信息。

近年来三重四级杆质谱在食品安全分析中得到了广泛的应用，它通常采用多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式，通过选择母离子，优化碰撞能量、去簇电压等质谱条件，用子离子进行定量和定性分析。在食品添加剂、农药残留、兽药残留、工业染料等非法添加物的检测中得到了广泛的应用。

近年来，一些不法商人为牟取暴利，在中成药、保健品和食品中非法添加化学药物，患者在不知情的情况下大量服用，可能造成严重的不良反应，严重威胁到人类健康。液质联用技术以其灵敏度高的优点，越来越多地应用到非法添加药物成分的鉴别中，成为打假治劣的一把利剑[18-22]。

1 材料与试剂

1.1 材料与试剂

阿司匹林（批号：100113-201405，含量99.8%，中检院）；双氯芬酸钠（批号：100334-200302，中检院）；布洛芬（批号：100179-201406，含量99.5%，中检院）；吲哚美辛（批号：100258-200904，含量99.9%，中检院）；甲醇（色谱纯，山东大禹）；水为实验室自制超纯水；待测样品为市售随机购买。

1.2 仪器与设备

LC-MS/MS液质联用仪[AB 4500Qtrap，日本岛津；液相色谱LC-20AT，电喷雾离子源（ESI）]；十万分之一电子天平（瑞士梅特勒公司）。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

ODS-3 C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流速0.8 mL/min；流动相为10 mmol/L乙酸铵水溶液（A）和乙腈（B），梯度洗脱：0～4 min，20%～95%B；4～7 min，95% B；7.1～10 min；20% B。柱温：35℃；进样量：5 μL。

1.3.2 质谱条件

质谱配电喷雾离子源（ESI）；负离子模式；气帘气（CUR）35 psi；离子化电压（IS）4 500 V；离子源温度（TEM）550 ℃；喷雾气（GS1）60 psi；辅助加热气（GS2）70 psi，碰撞气（CAD）Medium。扫描方式为选择离子扫描（MRM）。

1.3.3 对照品溶液的配置

分别精密称取各对照品5 mg左右于50 mL容量瓶中，加50%甲醇水溶解并定容至刻度线，再分别精密吸取0.1 mL于同一100 mL容量瓶中，50%甲醇水溶解并定容至刻度，得到质量浓度约为100 ng/mL的混合对照品溶液。

1.3.4 供试品溶液的制备

精密吸取保健酒25 mL于50 mL容量瓶中，50%甲醇水定容至刻度，摇匀，过0.22 μm有机系滤膜，即得，上液质检测。

1.3.5 质谱特征

取混合对照品溶液，按2.1小节色谱条件，2.2小节质谱条件检测。部分化学成分不能达到完全分离，但因各待测成分的离子碎片不同，通过质谱的高灵敏和高选择测定，不会造成相互间的干扰。4种化合物的质谱参数见表1。

表1 四种待测组分信息

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

2.1.1 母离子

Q1SCAN全扫，确定母离子的质荷比，根据这四种待测组分的化合物性质，选择离子源为电喷雾离子源（ESI），负离子模式扫描，扫描范围为分子量的正负50，扫描时间为2 min，在确定不是干扰离子的情况下选择响应值最高的质荷比，准确到小数点后一位。得到待测组分的母离子。

2.1.2 找到对应母离子的子离子

选择采集方法为MS2，采集模式和母离子一致，将去簇电压（DP）从20开始采集，依次增加到母离子的响应值强度为图片最高峰响应值的1/4左右。当总离子流图（TIC）平滑后，选择响应值最高的子离子。

2.1.3 优化去簇电压（DP）和碰撞能量（CE）

优化母离子的去簇电压（DP）和子离子的碰撞能量（CE），将DP设置为60，扫描5～180范围内的碰撞能量（CE），选择响应值最高的CE值（具体值见表1），确定CE值以后将DP范围设置为5～300扫描，得到响应值最高的DP值（具体值见表1）。建立MRM方法。

2.2 流动相的选择

试验待测组分布洛芬、双氯芬酸钠、吲哚美辛和阿司匹林是酸性化合物，所有待测成分在反相色谱中均能有效保留且在质谱电离时带负电，选择普通的C18色谱柱就能很好地满足检测需要。同时因为是负离子检测模式，故使用能促进电离的乙酸铵水溶液，能达到更高的响应值。

此方法通过优化4种待测组分的流动相，找到4种待测组分的母离子、子离子及最佳的去簇电压（DP）及碰撞能量（CE），能简单快速准确地检测出保健酒中的此4种非法添加。真正实现了快速、简便、准确的目的。目前液质联用在很多地方还不是很普及，所以因为仪器受限，只能在有这种仪器的实验室进行，未来随着此种仪器的普及，将会更加容易推广此种方法。

2.3 样品测定

按1.3.4小节制备供试品溶液，在上述色谱和质谱条件下，共测21批样品，全部为保健酒，其中一批检测出阿司匹林。标准品定量离子色谱图见图1～图4。阿司匹林阳性样品定量离子色谱图见图5～图8。

图1 布洛芬标准品定量离子色谱图

图2 双氯芬酸钠标准品定量离子色谱图

图3 吲哚美辛标准品定量离子色谱图

图4 阿司匹林标准品定量离子色谱图

图5 布洛芬样品定量离子色谱图

图6 双氯芬酸钠样品定量离子色谱图

图7 吲哚美辛样品定量离子色谱图

图8 阳性（阿司匹林）样品定量离子色谱图

因为保健酒基体复杂，用液相检测时，通常杂质较多，不易分开，导致假阳性，或目标峰和杂峰分不开，而无法准确定量。同时非法添加的化学药品含量极低，通常为痕量级别，液相的检出限太高，导致痕量的非法添加无法检出。文章采用液质联用的方法，以母离子、子离子、离子响应值比率及出峰时间来准确定性，以响应值高的子离子碎片准确定量。可以快速、准确地获得高质量、高分辨率和高灵敏度的多级质谱信息，准确快速地验证非法添加的化学成分，对供试品进行结果确证，提高检测的专属性。