木 仁，格根图雅，张 欢，冉田田，陈 志，文 狄，马 媛，徐文斌

（1. 黔南民族师范学院生物科学与农学院，贵州黔南 558000 ；2. 浙江大学动物科学学院，浙江杭州 310058）

鸡肠道中存在数量庞大、种类繁多的微生物菌群。微生物菌群不仅与营养物质的消化吸收相关，也与机体免疫密切相关。Yan 等[1]指出，饲料效率与乳杆菌属相对丰度存在明显的相关性，盲肠微生物群在提高饲料效率方面具有重要作用。Mahmoud等[2]研究发现，枯草芽孢杆菌的补充可加深商业肉鸡空肠隐窝深度，提高回肠对粗蛋白的消化率。直接饲喂市售益生菌可显著增加肉鸡胸腺的呼吸频率，极显著提高外周血单核细胞ATP 浓度及周转率，产生特异性免疫球蛋白G（IgG）的速度更快[3]。近年来，随着高通量测序技术快速发展，针对蛋鸡肠道微生物进行了大量研究。肠道微生物组成受品种、性别、日龄和日粮等因素的综合影响，并在不同肠段间存在一定差异[4-5]。但上述研究主要集中于商品化程度较高的蛋鸡品种，针对地方鸡种的研究较少。本试验以贵州省特有品种的长顺绿壳蛋鸡为研究对象，利用16S rRNA高通量测序技术，对十二指肠、回肠和盲肠内容物的菌群结构及功能进行综合评价，以期为长顺绿壳蛋鸡的饲养管理提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

20 只健康、体重无明显著差异的27 周龄长顺绿壳蛋鸡，购自贵州省长顺县某长顺绿壳蛋鸡养殖场。

参照《鸡饲养标准》（NY/T 33—2004）配制日粮，基础日粮组成及营养水平见表1。

表1 基础日粮组成及营养水平（风干基础）Tab.1 Composition and nutrient levels of basal diet (air-dry basis)

1.2 饲养管理

每只鸡单独饲养于笼内（笼宽36 cm×长48 cm×高38 cm），自由饮食，鸡舍温度（22±2）℃，每日保持连续光照16 h，按照日常管理程序进行清扫消毒。试验期35 d。

1.3 试验方法

1.3.1 各肠段内容物的收集

试验最后1 d，所有鸡禁食12 h，选择4 只鸡颈静脉放血处死。打开腹腔，十二指肠和回肠两端及盲肠的近端结扎剪下，快速转移至超净工作台。无菌剪刀剪开各肠段肠壁，无菌药匙取出内容物，放入无菌离心管，-80 ℃保存。

1.3.2 DNA提取及高通量测序

采用HiPure Stool DNA Kit 提取样品微生物总DNA，Qubit® dsDNA HS Assay Kit检测浓度。

16S rRNA V3 和V4 区扩增引物为：F 5'-CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT-3'和R 5'-GGACTACNVGGGTWTCTAATCC-3'。

扩增程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性5 s，57 ℃退火90 s，72 ℃延伸10 s，24个循环；72 ℃延伸5 min。

PCR 扩增结果鉴定（1.5% 琼脂糖凝胶电泳）后，利用Infinite 200 PRO 酶标仪（Tecan）检测文库浓度，通过Illumina MiSeq 平台测序，扩增和测序工作由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

1.4 数据统计与分析

利用Vsearch 1.9.6 软件[6]对有效序列进行聚类，相似性水平为97%[7]。 将序列聚类成为操作分类单元（operational taxonomic units，OTUs）。基于Qiime 1.9.1 软件将OTUs代表序列与Silva数据库（https://www.arb-silva.de/）进行比对，RDP classifier贝叶斯算法[8]对OTUs代表序列从门到属进行物种注释，通过Qiime 1.9.1软件计算α多样性指数。使用PICRUSt v1.0.0软件[9]完成宏基因组的预测，结合KEGG数据库进行注释，从而获得功能丰度信息。

将α多样性指数、菌群和富集基因相对丰度数据导入SPSS 25.0 软件，采用单因素方差分析中的LSD 法分析符合正态分布及方差齐性的数据，不符合的数据采用非参数检验中的Kruskal-Wallis 法进行分析。结果以“平均值±标准差”表示，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 各肠段内容物的菌群测序结果（见表2、图1）

由表2可知，盲肠的原始序列、有效序列及OTUs数量最多，十二指肠最少。

表2 各肠段内容物的菌群测序结果Tab.2 Sequencing results of bacterial flora in the contents of each intestinal segment

由图1 可知，3 组共有的OTUs 为2 个，十二指肠特有4个、回肠特有17个、盲肠特有236个。

图1 各肠段内容物的菌群Venn图Fig.1 Venn diagram of microflora of content of each intestinal segment

2.2 各肠段菌群α多样性分析结果（见表3）

由表3 可知，随着肠道的延伸，α 多样性指数明显增加。其中，盲肠的Ace 指数、Chao-1 指数和Shannon 指数极显著高于十二指肠和回肠（P＜0.01）。盲肠的Simpson指数显著高于十二指肠（P＜0.05）。回肠Ace 指数和Chao-1指数显著高于十二指肠（P＜0.05）。

表3 各肠段菌群α多样性分析结果Tab.3 Analysis results of α diversity of intestinal flora

2.3 各肠段肠道菌群门水平相对丰度（见表4）

由表4 可知，十二指肠和回肠共注释到2 个相对丰度高于1%的菌门，分别为厚壁菌门和放线菌门，其中厚壁菌门为绝对优势菌门；而盲肠共注释到3个相对丰度高于1%的菌门，分别为拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门，其中拟杆菌门和厚壁菌门为优势菌门。十二指肠和回肠的厚壁菌门相对丰度极显著高于盲肠（P＜0.01），但拟杆菌门相对丰度极显著低于盲肠（P＜0.01），变形菌门相对丰度显著低于盲肠（P＜0.05）。

表4 各肠段肠道菌群门水平相对丰度Tab.4 Relative abundance of gut flora in each intestinal segment at phylum level单位：%

2.4 各肠段肠道菌群属水平相对丰度（见表5）

由表5 可知，平均相对丰度高于1% 的共有19 个属。其中十二指肠3个，回肠2个，盲肠17个。十二指肠和回肠的优势菌属为乳杆菌属，平均相对丰度分别高达94.133%和95.273%，极显著高于盲肠（P＜0.01）。盲肠的优势菌属为拟杆菌属，平均相对丰度为40.548%，极显著高于十二指肠和回肠（P＜0.01）。

表5 各肠段肠道菌群属水平相对丰度Tab.5 Relative abundance of intestinal flora in each intestinal segment 单位：%

2.5 各肠段KEGG分析结果（见表6～表8）

表6 各肠段KEGG一级通路的富集基因相对丰度Tab.6 Relative abundance of enriched genes in KEGG primary pathway in each intestinal segment 单位：%

表8 各肠段新陈代谢相关KEGG三级通路富集基因相对丰度Tab.8 Relative abundance of genes enriched in KEGG tertiary pathway related to metabolism in each intestinal segment 单位：%

由表6 可知，富集基因相对丰度高于1% 的KEGG 一级通路共5个。其中新陈代谢通路中富集基因相对丰度最高（44.74%～49.34%）。回肠环境信息处理通路的富集基因相对丰度显著高于盲肠（P＜0.05），但未分类的基因相对丰度显著低于盲肠（P＜0.05）。

由表7 可知，富集基因相对丰度高于1% 的KEGG 二级通路共18 个，其中十二指肠16 个，回肠17 个，盲肠18 个。盲肠辅因子与维生素的代谢以及聚糖生物合成与代谢通路中，富集基因相对丰度极显著高于十二指肠和回肠（P＜0.01）。盲肠能量代谢、转录以及分类与降解通路中，富集基因相对丰度显著高于回肠（P＜0.05）。盲肠氨基酸代谢及其他次生代谢物的生物合成通路中，富集基因相对丰度显著高于十二指肠（P＜0.05）。回肠膜运输通路中富集基因相对丰度极显著高于盲肠（P＜0.01）。

表7 各肠段KEGG二级通路富集基因相对丰度Tab.7 Relative abundance of genes enriched in KEGG secondary pathway in each intestinal segment 单位：%

由表8 可知，富集基因相对丰度高于1% 的KEGG 新陈代谢相关三级通路共11 个，其中十二指肠9 个，回肠8个，盲肠10个。十二指肠嘧啶代谢通路富集基因相对丰度显著高于盲肠（P＜0.05）。盲肠甲烷代谢以及丙氨酸、天冬氨酸与谷氨酸代谢通路富集基因相对丰度极显著高于十二指肠和回肠（P＜0.01）。

3 讨论

前人基于PCR-DGGE技术分析普通商品蛋鸡消化道不同部位菌群组成，发现盲肠内菌群最丰富，其次为回肠，十二指肠丰富度最低[10]。本研究基于16S rRNA高通量测序技术，首次检测长顺绿壳蛋鸡十二指肠、空肠和盲肠菌群结构，并结合PICRUSt 对功能进行了预测，发现随着肠道延伸，α多样性指数及特有OTUs个数明显增加。

肠道主要微生物为厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门[1,11-12]。本研究发现，长顺绿壳蛋鸡十二指肠和回肠的优势菌门为厚壁菌门，平均相对丰度高于96%。与京红蛋鸡空肠[12]、新杨黑羽蛋鸡和海兰褐回肠[13]厚壁菌门相对丰度高于90%的研究结果较为相近；但与矮小型褐壳蛋鸡[1]、罗曼蛋鸡[11]和京红蛋鸡[12]的等研究结论具有一定差异。新杨黑羽蛋鸡和海兰褐盲肠厚壁菌门相对丰度分别为54%和52%，拟杆菌门分别为27% 和33%[13]，与本研究结果具有一定差异。乳杆菌属是蛋鸡十二指肠和空肠主要的菌属，拟杆菌属是盲肠主要菌属，但上述菌属相对丰度在不同研究中差异较大[1,11-13]，此差异主要与不同日龄、不同品种、饲料营养成分差异及饲养环境等综合因素有关。

张艳[14]基于KEGG 数据库，对科宝500、罗斯308 和矮脚黄鸡等的前肠与后肠的微生物功能基因进行了对比分析；结果发现，前肠有关遗传信息处理的复制与修复和翻译通路中富集基因相对丰度较高，但遗传信息处理的转录、折叠、分类与降解及环境信息处理的膜运输通路中的基因富集情况与本研究结果相比具有一定差异，但具体原因需进一步探索。矮小型褐壳蛋鸡代谢相关的功能基因主要富集于盲肠[1]。后肠氨基酸代谢、能量代谢、辅因子与维生素代谢等通路中富集基因相对丰度较高[14]，与本研究结果类似。本研究发现，盲肠甲烷代谢和丙氨酸、天冬氨酸与谷氨酸代谢通路中富集基因相对丰度极显著高于十二指肠和回肠，表明盲肠中大量微生物参与营养物质的消化代谢，与该部位已知消化吸收功能相符。

4 结论

长顺绿壳蛋鸡不同肠段微生物多样性由低到高的顺序为十二指肠＜回肠＜盲肠。十二指肠和回肠主要菌属为乳酸杆菌属，盲肠主要菌属为拟杆菌属。各肠段微生物功能基因主要富集于KEGG的新陈代谢通路，其中盲肠氨基酸代谢、能量代谢和辅因子与维生素代谢等通路的富集基因相对丰度较高。盲肠微生物的营养代谢作用更活跃。