文静，李 智，张建武，吴小桥，朱泽超，徐海薏，牛 娜

（1.川北医学院，四川 南充 637100；2.川北医学院附属医院，四川 南充 637100）

壁虎为壁虎科动物无蹼壁虎Gekko swinhonis Guenther、多疣壁虎Gekko japonicus Dumeril et Bibron或蹼趾壁虎Gekko subpalmatus Guenther的干燥全体，别名守宫，其性寒、味咸，有小毒，入肝经，具有祛风定惊、散结解毒等功效[1]。古代医学典籍中关于守宫的记载有很多，最早见于《本草纲目》[2]，主治“中风瘫痪，手足不举，或历节风痛，及风惊痫，小儿疳痢，血积瘰，疗蝎螫”；清·赵其光在《本草求原》中提到守宫入血分，可治血病，有滋阴降痰之功[3]；《四川中药志》称其能“驱风、破血积包块，治肿瘤”[4]。现代临床研究发现，守宫可治疗乳癖、抗肿瘤[5-6]。守宫主要含有多肽类、核苷类和多糖类等成分。现代药理研究显示，其具有诱导肝癌细胞分化，抑制肝癌细胞增殖，调节机体免疫力，抑制肿瘤细胞生长的作用[7]。随着科学技术的进步，分子生物学研究领域不断拓展，已有研究证实多糖类成分在抗癌、抗肿瘤及提高机体免疫力等方面发挥着重要作用。闫祝辰等[8]研究发现，守宫多糖可增强肝癌抗原活化的淋巴细胞的细胞毒作用，促进淋巴细胞对肝癌的杀伤作用。巴一等[9]发现从守宫中提取分离出的守宫硫酸多糖可诱导人肝癌BEL-7402细胞凋亡。黄卉等[10]研究复方金龙胶囊（守宫为君药）治疗脑肿瘤的药理机制，认为守宫与金钱白花蛇、蕲蛇合用可干预多基因、多通路、多环节，发挥抗脑肿瘤的作用。《中华人民共和国药典》中尚未收载守宫含量测定方法，为进一步完善其质量标准，本研究采用苯酚-浓硫酸显色法对其多糖类成分进行测定。

1 研究材料

1.1 仪器与试剂 仪器:粉碎机（上海化三粉体设备有限公司），Multiskan Skyhigh紫外分光光度计（赛默飞世尔科技公司），RE5000B旋转蒸发器（郑州英峪领科仪器设备有限公司），Secura-1CN电子分析天平（瑞士赛多利斯），LD4-2A离心机（湖南湘仪仪器有限公司）。试剂:葡萄糖（默克公司，货号Y0001745，供含量测定用），浓硫酸（国药集团化学试剂有限公司，纯度98.08%，批号:20180507），苯酚（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号:P100765），无水乙醇（Sigma-Aldrich，含醇度≥99.5%，产品号:459836），蒸馏水（MILL-Q纯水仪制备）。

1.2 实验样品 3种守宫均购买于四川荷花池中药材市场，分别来源于河北承德（生产批号:A20200123），辽宁本溪（生产批号:20200514），北京密云（生产批号:20200328）。守宫购回后用粉碎机粉碎后过筛（80目筛），密封，置于干燥处－20℃保存。

2 研究方法

2.1 对照品溶液的制备 取于105℃环境下干燥至恒重的葡萄糖对照品约12.50 mg，精密称定，置于50 m L量瓶中，加水溶解并稀释至50 m L，摇匀，得到浓度为0.25 mg/m L的葡萄糖标准储备液。分别准确吸取葡萄糖标准储备液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 m L，置于25 m L量瓶中，并加水稀释并定容至25 m L，分别得 到 系 列浓度为10.00、15.00、20.00、25.00、30.00、35.00μg/m L的葡萄糖标准溶液。

2.2 守宫供试品溶液的制备 ①准确称取守宫样品25 mg，置于25 m L的量瓶中，加水摇匀定容至25 mL，摇匀；温室超声（400 W）30 min，取滤液5 mL，3 500 r/min离心10 min，取上清液；将上述溶液稀释5倍，即得守宫总糖供试品溶液。②准确称取守宫样品400 mg，置于100 m L锥形瓶中，加入水20 m L，再加入无水乙醇（含醇量达85%），静置过夜；3 500 r/min离心5 min；精密吸取上清液，55℃旋转蒸干，残渣用水溶解，并转移至25 m L量瓶中，加水定容至25 m L，将上述样品稀释50倍，即得守宫游离糖供试品溶液。

2.3 苯酚-浓硫酸显色反应 精密吸取上述葡萄糖标准溶液、守宫供试品溶液各2 m L，分别置于20 m L具塞玻璃试管中，再分别加入5%苯酚溶液1 m L，混匀，再迅速加入浓硫酸7 m L，摇匀，于40℃水浴中保温30 min，取出，立即置于冰水中5 min，待恢复至室温，以水为随行空白，于490 nm处测定吸光度。

3 方法学验证

3.1 确定最大吸收波长 分别对经苯酚-浓硫酸显色的葡萄糖对照品溶液（25.00μg/m L）和守宫总糖供试品溶液在220～800 nm进行光谱扫描，最终确定最大吸收波长为490 nm。

3.2 线性关系 选取2.5 m L水显色后的溶液作为空白，绘制标准曲线，见图1。线性回归方程:Y＝0.013 8X＋0.016 4，R2＝0.994 5，线性范围10.00～35.00μg/m L。

3.3 精密度实验 分别精密吸取守宫供试品溶液2 mL，重复测定吸光度6次，结果分别为13.54、13.54、13.54、13.41、13.39、13.41，相对标准偏差（RSD）为0.55%，表明仪器精密度良好。

3.4 守宫总糖、游离糖供试品溶液稳定性 分别精密吸取守宫总糖、游离糖供试品溶液各2 m L，分别经苯酚-浓硫酸显色后测定放置0、2、4、6、8、10 h的吸光度，总糖供试品溶液的RSD为1.15%，游离糖供试品溶液的RSD为2.46%，提示两种供试品溶液在0～10 h的稳定性均良好。见表1。

表1 守宫总糖、游离糖供试品溶液稳定性实验结果

3.5 重复性实验

3.5.1 总糖样品重复性实验 分别称取守宫样品6份，每份约25 mg，置于25 mL量瓶中，加水适量使其溶解，再加水定容至刻度，摇匀，3 500 r/min，离心10 min，取上清液；再将守宫上清液稀释5倍，即得总糖供试品溶液。6份总糖供试品溶液各精密吸取2 mL，RSD为0.48%，表明重复性良好。

3.5.2 游离糖样品重复性实验 分别称取守宫冻干粉6份，各约400 mg，分别置于100 m L锥形瓶中，加水20 m L溶解，再加入无水乙醇，使其含醇量达到85%，静置过夜，3 500 r/min离心10 min，取上清液，55℃旋转蒸干，残渣用水溶解，转移至25 m L量瓶中，并定容至刻度，再将上述样品稀释50倍，即得游离糖供试品溶液。6份游离糖供试品溶液各精密吸取2 m L，RSD为2.10%，表明重复性良好。

3.6 加样回收实验

3.6.1 守宫总糖加样回收实验 取30.00μg/m L的葡萄糖标准溶液4 400μL加水稀释至10 mL，得葡萄糖对照品溶液13.20μg/m L。分别称取守宫样品6份，每份约25 mg，分别置于25 m L量瓶中，加水适量使溶解，再加水定容至25 mL，摇匀，3 500 r/min离心10 min，取上清液。精密吸取1 mL上清液，置于5 mL量瓶中，各加入1 m L葡萄糖对照品溶液（13.20μg/m L），定容至刻度，摇匀。苯酚-浓硫酸显色后测定吸光度，计算多糖含量。回收率＝（样品含量＋对照品加入量）/测得量×100%。结果显示，总糖平均回收率为100.38%，RSD＝1.60%。见表2。

表2 守宫总糖加样回收实验

3.6.2 守宫游离糖加样回收实验 取30.00μg/m L的葡萄糖标准溶液3 500μL加水稀释至10 m L，得葡萄糖对照品溶液10.50μg/mL。分别称取守宫样品6份，各400 mg，分别置于100 m L锥形瓶中，加水20 m L溶解，再加入无水乙醇，静置过夜，3 500 r/min离心10 min，取上清液，蒸干，残渣用水溶解，转移至25 m L量瓶中，并定容至25 m L；精密吸取1 m L续滤液，置于50 m L量瓶中，各加入1 m L葡萄糖对照品溶液（10.50μg/m L），定容至刻度，摇匀。苯酚-浓硫酸显色后测定吸光度，计算多糖含量。结果显示，游离糖平均回收率为100.16%，RSD＝2.34%。见表3。

表3 守宫游离糖加样回收实验

3.7 守宫样品多糖含量测定 利用紫外分光光度计测定3个批次的守宫样品的多糖含量，每个批次重复3次，多糖含量百分率＝（总糖百分含量－游离糖百分含量）×100%。不同产地守宫中多糖含量差异，其中由高到低依次为北京密云含量为6.363%、辽宁本溪含量为4.584%、河北承德含量为3.501%。见表4。

表4 守宫样品多糖含量测定结果(%)

4 讨论

守宫作为传统的中药，具有祛风、活络、散结、解毒功效，可用于治疗中风偏瘫、关节疼痛、风湿痛及恶性肿瘤（如食管癌、胃癌、肝癌、肺癌）的治疗。守宫中多糖类成分是其主要抗肿瘤的活性成分之一[5，7]，但《中华人民共和国药典》并未设立守宫含量测定标准。多糖含量测量方法通常分为两大类，一类是多糖含量直接测定法，如苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、3，5-二硝基水杨酸（DNS）法等；另一类是多糖含量间接测定法，如高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）、离子色谱法（IC）等，此类方法操作烦琐，对样品处理和要求高，不适合快速检测，对多数中药多糖也不适宜。目前，多糖的含量测定多采用紫外分光光度法，该方法操作较简单迅速，且准确度高，适合大量检测，能更好满足现阶段要求，但不同的中药多糖有其适合的含量测定方法，其中苯酚-浓硫酸法是使用最多的。故本文采用苯酚-浓硫酸法建立守宫多糖的测定，并用该方法测定不同产地守宫中多糖含量，可为守宫后续研究提供参考。