气相色谱法用于米诺膦酸关键中间体的质量控制

2022-08-08张绿茵兰为环刘朋李爽唐海

化工与医药工程 2022年3期

张绿茵，兰为环，刘朋，李爽，唐海

（1.江苏天士力帝益药业有限公司，天津 300400；2.天士力控股集团有限公司，天津 300400）

米诺膦酸（minodronic acid）化学名为1-羟基-2-{咪唑并［1，2-a］吡啶-3-基}亚乙基-1， 1-双膦酸，为第三代含氮芳杂环双膦酸盐类药物，米诺膦酸能够抑制破骨细胞法尼焦磷酸合成酶（FPP）的活性，降低骨转换，进而防治骨质疏松，是由日本小野药品工业株式会社和Astellas制药株式会社共同开发，于2009年在日本上市[1-3]，临床上常用的为其一水合物，结构式见图1[4]。

图1 米诺膦酸水合物Fig.1 Minodronic acid hydrate

根据米诺膦酸的合成路线[5-6]，米诺磷酸是以2-氨基吡啶和反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯为起始原料，经过亲核加成反应制得关键中间体2-（咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基）乙酸乙酯，然后再经水解、磷酸化、精制获得米诺膦酸成品。

图2 中间体合成路线Fig.2 Intermediate synthesis route

反应过程中，2-氨基吡啶既是反应物，又具有一定的碱性，在乙腈回流的高温下，随着产物的生成，也产生了水，通过浓缩除溶剂得到该中间体，该中间体为油状液体，工艺过程实际操作时，浓缩后就连续进行下一步反应，故最初该中间体没有建立相应的质量标准，仅通过反应过程TLC监控，但由于TLC方法对起始原料的残留不能准确定量，造成后续反应较难除去，影响最终产品质量，故此文建立了一个更加有效监测该中间体的GC的方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

7890A型气相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；XS105型DU电子分析天平（梅特勒-托利多国际有限公司）；Agilent DB-624（30 m×0.320 mm，1.8 µm）毛细管柱，FID检测器；

甲醇（批号，109845077849，HPLC级），购自默克公司；乙腈（批号：JA076630，HPLC级），购自默克公司；2-氨基吡啶（批号：20190312，99.96%），购自安徽星宇化工有限公司；反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯（批号：MN-01-181201，97.31%），购自北京海步医药科技有限公司；中间体1（批号：MN1905241a、MN1905242a、MN1905243a），自制；

2 结果与讨论

2.1 色谱条件

以6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷为固定相的毛细管为色谱柱，起始温度为40 ℃，保持5 min，以25 ℃/min的速率升温至180 ℃，再以40 ℃/min的速率升温至240 ℃，保持10 min；检测器为氢火焰离子化检测器，检测器温度260 ℃，进样口温度180 ℃；以氮气为载气，流速为1.5 mL/min，分流比为10∶1；进样体积1 µL。

2.2 溶液配制

2.2.1 空白溶液

甲醇作为空白溶液。

2.2.2 对照品溶液

取乙腈、反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯、2-氨基吡啶各适量，精密称定，用甲醇定量稀释制成每1 mL中分别约含0.5 mg、0.025 mg、0.25 mg的混合溶液。

2.2.3 供试品溶液

取中间体1适量，精密称定至量瓶中，加入甲醇定量稀释制成每1 mL中约含5 mg的溶液；

2.3 专属性考察

取2-氨基吡啶对照品约25 mg，精密称定，置25 mL量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为2-氨基吡啶定位溶液；取反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯对照品约25 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，用溶剂溶解稀释至刻度，摇匀，作为反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯定位溶液；取乙腈约20 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，用溶剂溶解稀释至刻度，摇匀，作为乙腈定位溶液；取上述2-氨基吡啶定位溶液、反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯定位溶液、乙腈定位溶液及2.2项下空白溶剂、供试品溶液、对照品溶液按照2.1项下的色谱条件进行测定，记录色谱图，结果如图3所示。结果表明空白溶液不干扰测定，各组分之间分离度均大于1.5，说明该检测方法专属性好。见图3。

图3 气相色谱图（1：乙腈； 2：反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯； 3：2-氨基吡啶）Fig.3 Gas chromatogram （1：acetonitrile； 2：ethyl trans-4-oxo-2-butenoate； 3：2-aminopyridine）

2.4 检测限和定量限考察

取2.3项下的反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯定位溶液，逐步稀释，按照2.1项下的色谱条件进行测定，其中检测限溶液测定3次，定量限溶液测定6次，分别记录反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯峰的信噪比（S/N）平均值。以信噪比大于3∶1时测得的浓度为检测限，以信噪比大于10∶1时测得的浓度为定量限。方法考察的检测限和定量限溶液浓度分别为为0.68 µg/ mL和2.72 µg/mL，分别相当于供试品溶液浓度水平0.01%和0.05% 。

2.5 线性关系考察

精密称取反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯对照品、乙腈与2-氨基吡啶各适量，加甲醇稀释制成系列浓度的混合线性溶液，依次进样，各三针，按照2.1项下的色谱条件进行测定，记录色谱图，考察各组分浓度与峰面积的线性关系，并以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，用最小二乘法计算线性回归图，结果表明乙腈在0.25 ～ 1.52 mg/mL浓度范围内线性关系良好，线性方程为y= 737.613 5x- 7.246 9，R2= 0.999 9；反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯在0.01 ～ 0.08 mg/mL浓度范围内线性关系良好，线性方程为y= 296.105 9x+ 3.264 7，R2= 0.981 3；2-氨基吡啶在0.13 ～ 0.78 mg/mL浓度范围内线性关系良好，线性方程为y= 1 065.328 8x- 1.541 3，R2= 0.999 9。说明该方法在规定的质量浓度范围内线性关系良好。

2.6 回收率考察

分别精密称取乙腈、反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯与2-氨基吡啶各适量，加甲醇稀释制成每1 mL约含乙腈2.5 mg、反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯0.125 mg、2-氨基吡啶1.25 mg的混合储备液。

按2.2.3项下供试品溶液的配制方法平行配制供试品溶液2份，作为空白供试品溶液；

精密称取供试品（中间体1）约250 mg，称取9份，分成3组，每组分别精密加入混合储备液适量，用溶剂稀释至刻度，制成各限度浓度80%、100%和120%的供试品溶液各3份，共9份，摇匀即得，按照2.1项下的色谱条件进行测定，记录色谱图，计算回收率。结果如表1所示，结果表明该方法的准确度较高，适用于米诺膦酸中间体中乙腈、反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯及2-氨基吡啶的检查。

表1 回收率试验结果Tab.1 The results of recoveries（n=9）

（续表）

2.7 精密度

2.7.1 仪器精密度实验

取2.2.1项下对照品溶液，连续进样6针，按照2.1项下的色谱条件进行测定，记录色谱图，乙腈出峰时间RSD为0.028%，峰面积RSD为0.38%；反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯出峰时间RSD为0.004 5%，峰面积RSD为1.0%；2-氨基吡啶出峰时间RSD为0.004 6%，峰面积RSD为0.38%。仪器精密度良好。

2.7.2 方法精密度实验

按2.2.3项下供试品溶液的配制方法平行配制供试品溶液6份，同时配制对照品溶液2份，按照2.1项下的色谱条件进行测定，记录色谱图，6份供试品溶液中乙腈含量RSD为2.8%，反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯含量RSD为2.8%，2-氨基吡啶含量RSD为3.0%，方法重复性好。

2.7.3 中间精密度实验

按2.2.3项下供试品溶液的配制方法平行配制供试品溶液6份，同时配制对照品溶液2份，由不同的分析人员、不同时间、不同仪器、不同色谱柱，按照2.1项下的色谱条件进行测定，记录色谱图，结果中间体1供试品（MN1905242a），乙腈含量RSD为3.0%，反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯含量RSD为4.2%，2-氨基吡啶杂质含量RSD为3.7%；结果表明，中间体1分析方法精密度良好。

2.8 耐用性

2.8.1 溶液稳定性

按2.2项下配制空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液，于室温放置0 h、2 h、4 h、16 h，按照2.1项下的色谱条件进行测定，记录色谱图，室温放置16 h，对照品溶液中乙腈峰面积RSD为0.40%，反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯峰面积RSD为3.8%，2-氨基吡啶杂质峰面积的RSD为1.2%；供试品溶液中乙腈含量RSD为0.48%，反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯含量RSD为3.1%，2-氨基吡啶杂质含量的RSD为2.1%；结果表明：中间体1对照品溶液、供试品溶液在室温放置16 h内稳定。

2.8.2 改变色谱条件

按2.2项下配制空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液，分别考察不同进样口温度、检测器温度、柱升温程序，对照品溶液中乙腈峰面积RSD为0.91%，反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯峰面积RSD为3.6%，2-氨基吡啶杂质峰面积的RSD为0.84%；供试品溶液中乙腈含量RSD为1.2%，反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯含量RSD为3.7%，2-氨基吡啶含量的RSD为1.4%；分离度均大于1.5。

2.9 样品检测

取3批样品，按照2.2.3项下的供试品溶液的配制方法平行配制2份，同时取对照品溶液2份，按照2.1项下的色谱条件进行测定，记录色谱图。结果按外标法以峰面积计算，中间体供试品MN1905241a批乙腈含量为3.88%、反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯含量为0.36%、2-氨基吡啶含量为4.03%；供试品MN1905242a批乙腈含量为3.35%、反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯含量为0.32%、2-氨基吡啶含量为3.98%；供试品MN1905243a批乙腈含量为3.62%、反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯含量为0.29%、2-氨基吡啶含量为4.47%；均符合限度要求。

3 讨论

3.1 限度的制定

米诺膦酸合成过程中，可能残留未反应完全的2-氨基吡啶与反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯，反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯在后续反应中，在碱性条件下，能发生水解而产生新的杂质，生成小分子有机物可溶于醇/水溶液而除去，而未除去的反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯由于在后边的步骤中难以去除，因此设定限度0.5%以下；2-氨基吡啶易溶于水和醇，若有剩余可通过调节pH值而有效除去，依据多批次样品检测结果和杂质清除实验结果，设定限度5.0%以下；乙腈作为回流溶剂，后续会通过烘干除去，并且在终产品中作为残留溶剂进行限度控制，因此该步骤中设定限度10.0%以下。