表亚囡，于晓娜，孙玉双，王利杰，李敏，焦云飞，杨轩，任毅然

（1.华北制药河北华民药业有限责任公司，石家庄 052165；2.抗生素酶催化与结晶技术国家地方联合工程实验室，石家庄 052165；3.河北省头孢类药物制备技术创新中心，石家庄 052165）

注射用头孢噻肟钠为赛诺菲万安特有限公司研究开发的第三代头孢菌素，商品名为凯福隆，分别在德国、美国、法国、日本上市。中检院姚蕾等发表的文献《229批国产注射用头孢噻肟钠的质量评价》[1]中提及本品注射液的原研为1980年首次在德国上市。注射用头孢噻肟钠抗菌谱广，抗菌活性强，临床应用广泛。头孢菌素一般由微生物发酵、纯化、精制以及化学修饰等过程制得，可能含有的杂质情况较常规化学合成药品更为复杂。

根据原料药的合成路线分析，并经专业的软件评估，头孢噻肟钠原料药中含有的致突变杂质有2-巯基苯并噻唑和二硫化二苯并噻唑，前者主要产生途径为合成头孢噻肟酸时形成的副产物，后者主要来源为合成AE活性酯时残留。因2-巯基苯并噻唑在溶液形态可与二硫化二苯并噻唑相互转化，因此开发方法将二硫化二苯并噻唑转化为2-巯基苯并噻唑进行共同控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AT高效液相色谱仪（岛津公司）

YMC色谱柱（YMC -Pack Pro C18，4.6 mm×150 mm，3 µm）

1.2 药品与试药

乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水，谷胱甘肽、磷酸、二甲基亚砜为分析纯。

2-巯基苯并噻唑（纯度：95.18%，批号：0831909，厂家：TCI）；二硫化二苯并噻唑（纯度：97.6%，批号：5A7FG，厂家：TCI）。

2 方法与结果

2.1 方法开发

文献资料表明，2-巯基苯并噻唑在溶液形态及体内可以自由转化为其氧化形态，如图1所示，即二硫化二苯并噻唑[2-3]，采用分别控制的策略对这两个杂质进行检测难度极大且不甚合理。

图1 2-巯基苯并噻唑与二硫化二苯并噻唑的相互转化Fig.1 Mutual transformation of 2-Mercaptobenzothiazole and dibenzothiazole disulfide

二硫化二苯并噻唑不稳定，与2-巯基苯并噻唑可相互转化，使用谷胱甘肽试剂可将二硫化二苯并噻唑还原成2-巯基苯并噻唑，2-巯基苯并噻唑在319 nm处有较强紫外吸收，因此通过检测2-巯基苯并噻唑从而对头孢噻肟钠中的2-巯基苯并噻唑和二硫化二苯并噻唑的含量进行合并控制。

2.2 色谱条件与系统适用性

色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充柱，流动相为0.2%磷酸（量取磷酸0.2 mL至100 mL量瓶中，加水稀释至刻度）乙腈=80∶20混匀，过滤。流速为0.7 mL/min，柱温为40 ℃，检测波长为319 nm，进样量20 μL。

图2 二硫化二苯并噻唑还原为2-巯基苯并噻唑原理Fig.2 Principle of dibenzothiazole disulfide reduction to 2-Mercaptobenzothiazole

测定法精密量取灵敏度溶液和系统适用性溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，灵敏度溶液色谱图中，目标杂质峰信噪比不小于10；系统适用性溶液色谱图中，目标杂质峰与邻近峰分离度不小于1.5。

精密量取2-巯基苯并噻唑对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，连续进样6次，目标杂质峰面积RSD≤10.0%；精密量取二硫化二苯并噻唑对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，二硫化二苯并噻唑对照品中2-巯基苯并噻唑峰面积相对于2-巯基苯并噻唑对照品中2-巯基苯并噻唑峰面积的回收率在90.0% ～ 110.0%。

精密量取供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液色谱图中如有目标杂质峰，记录目标杂质峰的峰面积，以外标法计算目标杂质含量，应不大于0.002 8%。

2.3 样品溶液的配制

稀释剂 称取谷胱甘肽约1 g，置100 mL容量瓶，先加水30 mL溶解，再加甲醇稀释到刻度，混匀。

2-巯基苯并噻唑储备液1 精密称取2-巯基苯并噻唑适量，加二甲基亚砜溶解并定量稀释制成每1 mL含560 μg的溶液。

2-巯基苯并噻唑储备液2 精密移取1 mL 2-巯基苯并噻唑储备液1至100 mL量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀。

二硫化二苯并噻唑储备液1 精密称取二硫化二苯并噻唑适量，加二甲基亚砜溶解并定量稀释制成每1 mL含541 μg的溶液。

二硫化二苯并噻唑储备液2 精密移取1 mL二硫化二苯并噻唑储备液1至100 mL量瓶中，加稀释剂稀释至刻度摇匀。

系统适用性溶液取头孢噻肟钠约200 mg，精密称定至100 mL量瓶中，加适量稀释剂超声溶解，精密移取1 mL二硫化二苯并噻唑储备液2至同一量瓶中，再加稀释剂稀释至刻度，摇匀，于45 ℃加热反应30 min，冷却至室温，即得。

灵敏度溶液精密移取1 mL 2-巯基苯并噻唑储备液2至500 mL量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，于45 ℃加热反应30 min，冷却至室温，即得。

2-巯基苯并噻唑对照品溶液 精密移取1 mL 2-巯基苯并噻唑储备液2至100 mL量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，于45 ℃加热反应30 min，冷却至室温，即得。

二硫化二苯并噻唑对照品溶液 精密移取1 mL二硫化二苯并噻唑储备液2至100 mL量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，于45 ℃加热反应30 min，冷却至室温，即得。

供试品溶液取本品，精密称定，加稀释剂超声溶解并定量稀释制成每1 mL中含2.0 mg的溶液，于45 ℃加热反应30 min，冷却至室温。

2.4 有关物质方法验证

2.4.1 专属性

按照项下色谱条件，取稀释剂、2-巯基苯并噻唑溶液、头孢噻肟钠溶液、含有二硫化二苯并噻唑的头孢噻肟钠溶液分别进样，记录色谱图，结果见图3，空白溶液在二硫化二苯并噻唑保留时间处无色谱峰，头孢噻肟及其他杂质峰不干扰二硫化二苯并噻唑测 定。

图3 液相色谱图Fig.3 Liquid chromatogram

2.4.2 检测限与定量限

按照项下色谱条件，取2-巯基苯并噻唑储备液逐级稀释分别进样，记录色谱图，信噪比约为3时作为检测限溶液，并计算检测限；信噪比约为10时作为定量限溶液，并计算定量限，结果见表1、表2。

表1 检测限试验结果Tab.1 The detection limit

表2 定量限试验结果Tab.2 The quantitative limit

结论：检测限浓度为5.338 6 ng/mL（相当于头孢噻肟钠浓度为2.7ppm），S/N 均大于3∶1；均符合要求。定量限浓度为10.677 2 ng/mL（相当于头孢噻肟钠浓度为5.3 ppm），S/N均大于10∶1，峰面积RSD为3.3%。

2.4.3 线性与范围

取2-巯基苯并噻唑用稀释剂溶解并定量稀释制成浓度为5.6 μg/mL的对照品储备液，分别取储备液20 μL、50 μL、100 μL、200 μL、300 μL于10 mL量瓶，用稀释剂稀释到刻度摇匀，于45 ℃加热反应30 min，冷却至室温，作为线性溶液。

取各线性溶液进样，记录色谱图及峰面积。线性与范围试验结果见表3，线性方程见图4。

图4 2-巯基苯并噻唑的标准曲线Fig.4 Standard curve of 2-Mercaptobenzothiazole

表3 线性与范围试验结果Tab.3 Linearity and range

结论：2-巯基苯并噻唑在10.677 2 ～160.158 2 ng/mL 范围内线性关系良好，R2为0.999 8，Y轴偏差与100%响应值比值为4.6%，小于25%，均符合要求。

2.4.4 准确度

配制定量限浓度准确度溶液3份；分别配制50%、100%、150%限度的准确度溶液各三份，12份准确度溶液的加标回收率值在95.0% ～ 113.5%之间；12份准确度溶液加标回收率的RSD为5.8%，均符合要求。

2.4.5 重复性

配制6份重复性样品，按照限度量加入2-巯基苯并噻唑，6份重复性加标样品中2-巯基苯并噻唑含量的RSD为0.8%。

2.4.7 耐用性

改变流速、柱温、色谱柱等，不同条件下系统适用性均符合要求，各条件下测定值RSD为1.8%，均符合要求。

3 结论

（1） 根据致癌性数据库（CPDB数据库），杂质2-巯基苯并噻唑TD50数据为344 mg/ （kg·d）；根据ICH M7，按照一类致突变杂质计算2-巯基苯并噻唑的AI（可接受摄入量）= TD50 / 50 000×50 kg =344 μg/d；根据头孢噻肟钠最大日剂量为12 g，因此浓度限度为C=AI（μg/d）/剂量（g/d）=344/12（μg/g）=2.867×10-5（计算公式参见ICH Q3C）。根据LCDB数据库，二硫化二苯并噻唑TD50值为401 mg/ （kg·d），AI（可接受摄入量）为0.401 mg/ d，浓度限度为3.34×10-5。因2-巯基苯并噻唑在溶液形态可与二硫化二苯并噻唑相互转化，因此开发方法将二硫化二苯并噻唑转化为2-巯基苯并噻唑，为减少用药风险，进行严格控制，将2-巯基苯并噻唑和二硫化二苯并噻唑之和的控制限度定为2.8×10-5（以2-巯基苯并噻唑计）。按照限度2.8×10-5对上述两个杂质进行分析方法开发及验证工作。

（2）本实验建立了HPLC（紫外检测器）检测头孢噻肟钠中2-巯基苯并噻唑（M）和二硫化二苯并噻唑（DM）残留量的方法，以外标法进行计算，该方法具有检测限低（10-6级），准确度及精密度高，样品检测时间短（约11 min出峰）的优势。

（3）对照品及供试品均需要于45 ℃加热反应30 min，冷却至室温后进样。加热温度要控制好，保证每个样品都得到均匀加热，加热不均匀或时间不够可能会影响杂质出峰面积。