郭健敏，富 力，秦丽莉，陈文培，代彩玲，梁 纯，吴琪琪，杨 威1,

(1.广东省科学院动物研究所，广东省动物保护与资源利用重点实验室，广东省野生动物保护与利用公共实验室，广东 广州 510260；2.广东莱恩医药研究院有限公司，广东省药物非临床评价研究企业重点实验室，国家中药现代化工程技术研究中心中药非临床评价分中心，广东 广州 510990；3.香港科技大学，香港 999077;4. 大连富生天然药物开发有限公司,辽宁 大连 116000)

感冒是最常见的急性呼吸道感染性疾病，发生率较高。目前临床上主要以非甾体类解热镇痛药、甾体类药物或复方中药制剂，联合抗病毒药物治疗感冒[1]。但这些药物服用后均表现出不同程度的副作用或者仅有解热、抗病毒某一方面的疗效[2-4]。连翘是木犀科(Oleaceae)连翘属(Forsythia)植物，根据中国古代经典中医典籍如《本草纲目》、《神农本草经》、《证类本草》等记载，连翘具有清热解毒、消肿散结和疏散风热等功效[5]。在中国药典中，有114种中药制剂含有连翘的成分。连翘在临床上对感冒引起的发热、头痛和咽喉肿痛等有确切的治疗作用，其中连翘苷(phillyrin, KD-1)是连翘的主要活性成分之一，也是中国药典作为控制连翘药材质量的重要指标[6]。目前国内外对KD-1的药理研究主要有抗炎、降血脂、保肝、抗菌、抗病毒及脑神经系统保护方面的作用[7-9]，但其抗病毒和解热的联合作用鲜有报道。本研究拟采用不同呼吸道病毒株体外抗病毒模型，评价其体外抗病毒活性，通过流感病毒致小鼠急性肺炎模型和大鼠发热模型评价KD-1抗病毒、解热作用，并对其初步作用机制探索，为其在治疗流感等感染性疾病临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株及病毒株MDCK、A549、Vero和HEp-2细胞；流感病毒株A/H3N2/Hong Kong/8/68(H3N2)，人单纯疱疹病毒HSV-1、HSV-2，人腺病毒3型AdV-3，人呼吸道合胞病毒RSV，人肠道病毒71型EV71，以及流感病毒鼠肺适应株A/H1N1/FM/1/47(FM1)均购于美国ATCC，病毒株经鸡胚传代后保存于-80 ℃低温冰箱或液氮中。

1.2 动物ICR小鼠，(18～22) g，SD大鼠，(250～300) g，均为SPF级，雌雄各半，来源于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产使用许可证号为SCXK(湘)2013-0004，2013-0006，饲养温度(21～25) ℃，相对湿度40%～70%，12 h/12 h 明暗交替，级压差>10 Pa，实验动物使用许可证号：SYXK(粤)2015-0146。本研究动物实验已获得广东莱恩医药研究院有限公司实验动物管理与使用委员会(IACUC)批准。

1.3 药物及主要试剂连翘苷，由大连富生天然药物开发有限公司提供，批号：20160401，含量为90.2%；病毒唑注射液，天津药业集团新郑股份有限公司，批号：1606151；利巴韦林片，天津药业集团新郑股份有限公司，批号：16048402；丙泊酚注射液，广东嘉博制药有限公司，规格20 mL,200 mg，批号：1A160210；干酵母，河北马利食品有限公司，规格500 g/袋，批号：2016.02.01；DMEM培养基，批号：431594，Gibco；胎牛血清，批号SV30087.02，美国HyClone；大鼠白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)，大鼠环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)，大鼠前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)，大鼠精氨酸加压素(arginine vasopressin，AVP)，大鼠α黑色素细胞刺激素(α-melanocyte stimulating hormone，α-MSH)ELISA检测试剂盒均购自大连泛邦试剂有限公司。

1.4 主要仪器BSC1600-Ⅱ-B2型生物洁净安全柜，苏州净化设备有限公司；3543型二氧化碳培养箱，美国Thermo；ELx808酶标仪，美国BioTek；ST5020型多功能染色机、病理图像分析系统，德国LEICA。

1.5 KD-1体外抗病毒活性测定

1.5.1病毒毒力测定[10]将不同浓度(10-4～102PFU·L-1)的病毒液分别接种到96孔板中(长成单层细胞时接种)，流感病毒接种于MDCK细胞，腺病毒接种于A549细胞，疱疹病毒接种于Vero细胞，合胞病毒接种于HEp-2细胞，每个稀释度设4个复孔。于35 ℃，5% CO2培养5 d观察细胞情况，根据Reed-Muench法，计算各病毒的半数感染量(TCID50)。

1.5.2KD-1对细胞毒性的测定[11]取对数生长期的细胞分别加入96孔板中，待细胞长成单层后，弃培养液，换含有不同浓度的药液，置37 ℃、5 % CO2培养箱，培养5 d，用MTT比色法在酶标仪490 nm波长处测定吸光度值(OD值)。计算细胞抑制率，计算半数中毒浓度(TC50)和最大无毒浓度(TC0)。

1.5.3KD-1对病毒致细胞病变作用测试[12]分别加入不同浓度的病毒至细胞中，吸附1 h，用PBS洗去病毒液，加入对细胞无毒的KD-1和病毒唑注射液，每一病毒稀释度各加4个复孔，同时设病毒对照组，阴性对照组，阳性药物对照组(病毒唑注射液)。并置于35 ℃ CO2培养箱内培养，连续5 d，在倒置显微镜下观察病变，做好病变记录。然后用细胞MTT比色法，在酶标仪490 nm波长处测定吸光度值(OD值)，计算KD-1的IC50值和选择指数(Selection Index，SI)，SI=TC50/IC50，实验重复3次。

1.6 KD-1对流感病毒感染FM1小鼠所致肺炎的干预60只ICR小鼠适应性观察3 d，♀♂各半，按体质量和性别随机分成6组，10只/组。根据等效体表面积换算人的等效剂量，设KD-1剂量设为3.25、6.5、13 mg·kg-1以及正常对照组、模型组和阳性对照组利巴韦林片58.5 mg·kg-1；除正常对照组外，各组均于感染前1 d开始灌胃给药，连续5 d，正常对照组和模型组给予相同体积的0.5%羧甲基纤维素钠(0.5% CMC-Na)。各组动物用丙泊酚注射液按12 mg·kg-1浅麻醉，除空白组用生理盐水外，其余各组滴鼻50 μL小鼠流感病毒感染，感染量为15 TCID50，所有动物于感染后96 h进行解剖，取小鼠的肺进行称质量，计算肺指数。一部分肺组织匀浆后测定血凝滴度，一部分用于HE染色法观察肺组织病理变化。肺指数计算公式：肺指数=肺质量/体质量(g/g)。

1.7 KD-1对干酵母诱导SD大鼠发热的干预[13-14]90只SD大鼠，雄性，除正常对照组外，其余大鼠皮下注射20%干酵母10 mL·kg-1，测定大鼠造模5 h后体温，再根据选择体温升高0.8～2.0 ℃的大鼠随机分为模型对照组，阳性对照组(对乙酰氨基酚)，KD-1低、中、高剂量组，每组至少9只体温合格动物。分组后给予相应的药物10 mL·kg-1，KD-1剂量设为13.5、40.5、121.5 mg·kg-1，空白和模型对照组给予等容积的0.5% CMC-Na。测定动物给药后1、2 h的体温，并计算其与基础体温的差值(△T)。待动物体温测定完毕后，动物腹主动脉采血安乐死，取血浆和下丘脑的组织匀浆，双夹心ELISA法测定IL-1β、cAMP、PGE2、AVP、α-MSH含量。

1.8 KD-1分子对接验证在PubChem网站通过以“phillyrin”为关键词，得到KD-1的2D、3D化学结构式，保存为“SDF”格式，并将其转换为“pdbqt”格式；从PDB数据库和Uniprot数据库中下载IL-1β、cAMP、PGE2、AVP、α-MSH蛋白结构。利用AutoDock Tools软件处理该蛋白结构之后，设置对接盒子大小以及对接参数，利用AutoDock vina软件进行对接。最后通过PyMol软件的绘制得出对接结果。

1.9 统计学分析采用SPSS 17.0 统计软件进行数据分析，组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。

2 结果

2.1 KD-1体外抗病毒活性KD-1可减轻病毒引起的细胞病变程度，对H3N2、HSV-1、HSV-2、AdV-3、RSV和EV71均具有一定的抑制作用，SI值均>2。

2.2 KD-1对流感病毒感染FM1小鼠所致肺炎的影响如Fig 2，与正常对照组相比，模型对照组肺指数明显增加(P<0.01)；与模型对照组相比，各给药组的肺指数、血凝滴度均可显示出明显降低的趋势(P<0.01或P<0.05)。

2.3 肺组织病理变化结果如Fig 3所示，模型对照组支气管腔内大量淋巴细胞浸润，肺间质增宽，大量炎细胞浸润，成片肺泡腔实变，肺泡腔内浸润大量淋巴细胞、中性粒细胞等炎细胞，亦可见大量均只淡然渗出液，呈明显的渗出性炎症反应，提示小鼠出现严重的病毒性肺炎，造模成功。与模型对照组比较，各给药组小鼠肺组织病变程度明显减轻，特别对间质性肺炎改善明显。

Fig 1 KD-1 showed high anti virus activity in H3N2, HSV-1,HSV-2, AdV-3, RSV and EV71 in vitro cell n=3)

Fig 2 Effects of KD-1 on lung index and blood agglutination titer of FM1 infected n=10)

Fig 3 Effect of KD-1 on lung pathogenesis of FM1 infected mice(HE×100)

Fig 4 Effect of KD-1 on cytokine content in plasma and hypothalamus of dry yeast-induced fever rat

Fig 5 Docking results of KD-1 with 5 related protein molecules

2.4 KD-1对大鼠发热模型解热及作用机制解热作用结果显示，与正常对照组相比，模型组造模后5 h、给药后1 h、2 h动物体温升高值均明显升高(P<0.01)。与模型组相比，各给药组明显降低1 h、2 h的体温升高值(P<0.05或P<0.01)，提示着均有明显的解热作用。结果如Fig 4所示，与正常对照组相比，模型组血浆AVP含量降低(P<0.05)，IL-1β、cAMP 、PGE2、α-MSH含量未见明显改变。与模型组相比，对乙酰氨基酚组PGE2含量明显降低(P<0.05)。KD-1低剂量组AVP、α-MSH含量明显降低(P<0.05或P<0.01)。KD-1中高剂量组IL-1β、PGE2、AVP含量明显降低(P<0.05或P<0.01)。与正常对照组相比，模型组下丘脑cAMP含量降低(P<0.05)，IL-1β、AVP、PGE2、α-MSH含量未见明显改变。与模型组相比，对乙酰氨基酚组PGE2、α-MSH含量明显降低(P<0.01)。KD-1低、中、高剂量组IL-1β、PGE2含量明显降低(P<0.05或P<0.01)。

2.5 KD-1分子对接验证在PDB数据库和Uniprot数据库中得到了以下相关蛋白信息，利用AutoDock Vina分别计算出各个相关蛋白的最低结合能。从表中可以看出KD-1与蛋白的最低结合能均<-5 kcal·mol-1，所需能量越低，说明结合能越好。因此，分子对接结果可以验证该实验的研究。

3 讨论

流感发生的主要原因是由呼吸道病毒感染，从而引发急性呼吸道感染。越来越多的天然产物以其独特的多靶点用于预防和治疗流感，显示出良好的作用及其较小的毒副作用而引起了研究者的广泛关注[15-16]。本研究结果发现，KD-1在TC0条件下对H3N2、HSV-1、HSV-2、AdV-3、RSV和EV71均有一定的抑制作用，而且SI>2，结果提示KD-1是连翘抗呼吸道病毒的有效物质。

Tab 1 Effect of KD-1 on temperature rise of dry yeast-induced febrile rat model

Tab 2 Affinity and target information of KD-1 and inflammatory factors

流感病毒感染可导致炎症、肺损伤，这些组织病理学方面的改变将增加肺的质量[17]。为了评价KD-1对流感病毒导致的肺损伤的保护作用，本研究选用肺组织的血凝滴度、肺指数和肺组织病理学指标进行KD-1体内抗流感病毒活性的研究。Nguyen等[18]研究发现，KD-1到达体内后可明显的改善流感病毒所致的小鼠肺组织损伤，从而达到显著延长小鼠平均存活时间的效果。本研究结果表明：经流感病毒感染后的ICR小鼠，在灌胃给予KD-1后，各给药组的血凝滴度和肺指数较模型对照组相比明显减少，提示KD-1可抵抗流感病毒侵蚀肺部，这与Qu等[17]报道的KD-1体内抗流感病毒的研究结果相一致。肺病理组织学显示KD-1可减轻肺部病变程度，特别是对病毒感染间质性肺炎改善明显，KD-1对流感的治疗可能是通过抗病毒和抗炎两者共同起效发挥作用。

发热是病毒感染机体后的一个主要症状，而细菌、病毒、炎症性渗出物等都是常见的外源性致热源。当外源性致热源进入机体后，刺激机体产生内源性致热源，并作用于体温调节中枢使产热增加、散热减少而引起发热。本研究选用了干酵母致大鼠发热的模型评价KD-1的解热作用，并初步的考察其解热的作用机制。KD-1在给药后1～2 h对发热大鼠模型的体温均有明显降低的趋势，表明了KD-1具有明显的解热作用。在解热机制的研究中，选用了体温调节正向介质IL-1β、cAMP和PGE2，负向调节介质AVP、α-MSH进行相关研究。本试验结果表明，KD-1对模型大鼠血浆和下丘脑中cAMP含量均未见明显影响，表明其解热作用可能不是通过调节cAMP通路发挥的，而KD-1和对乙酰氨基酚均可降低血浆和下丘脑中PGE2的含量。KD-1结构中有与非甾体类药物类似的结构，因此从构效关系的角度分析KD-1能够降低PGE2的作用可能与该结构密切相关。

综上，KD-1具有较好的抗呼吸道病毒的作用，可明显改善肺组织病毒性间质性肺炎的病变，同时对外源性致热源诱发的发热具有明显的解热作用，作用机制与降低PGE2和IL-1β等炎性物质和炎症因子相关。推测KD-1可通过抗病毒、解热及抗炎的综合作用“标本兼治”起到抗流感的作用。