李锡萱，谭婧萱，李琳杰，翟学佳，吕永宁

(华中科技大学同济医学院附属协和医院药学部，武汉 430022)

卒中是全球第二大致死原因，且卒中患者的预后较差，有80%会出现永久性残疾[1]。根据脑生理及血流变化的差异，卒中大致能够分为两大类型：因脑内血管破裂引起的出血性卒中(intracerebral hemorrhage，ICH)以及因脑内动脉阻塞引起的缺血性卒中(ischemic stroke，IS)，其中缺血性卒中占比85%～87%[2-3]。缺血性卒中的基本成因是流向脑实质的血流因大动脉粥样硬化、小血管闭塞或心肌梗死等发生中断，从而造成脑局部的氧气及能量供应中断[4]。缺血性卒中发生后，脑组织的缺血缺氧往往造成兴奋性毒性、氧化应激、蛋白质错误折叠、神经炎症、细胞死亡及血脑屏障破坏等一系列脑损伤事件[5-8]。其中，细胞死亡事件不仅造成了缺血性卒中后神经细胞的损失，也会造成脑小胶质细胞及星形胶质细胞的丢失，直接导致了大脑损伤，使卒中患者的恢复变得十分困难，造成终身残疾[9]。

细胞的死亡包括细胞凋亡、自噬依赖性细胞死亡、细胞坏死等，许多研究表明这些过程密切地影响着缺血性卒中的预后[10-11]。近年来，研究表明一种与炎症密切相关的新型细胞程序性死亡方式——细胞焦亡能够引发缺血后的炎症反应，加重脑组织的损伤[12]。细胞焦亡为阐明缺血性卒中的机制提供了新的途径，抑制细胞焦亡过程也成为了缺血性卒中治疗的新方向。本文将阐释细胞焦亡与缺血性卒中机制的关联，并对与细胞焦亡相关治疗靶点及药物研究进行综述。

1 细胞焦亡与凋亡的异同

细胞焦亡(pyroptosis)于2001年被首次提出，最初用来描述被沙门菌或志贺菌感染的巨噬细胞中发生的半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)依赖性细胞程序性死亡过程[13]。虽然细胞焦亡过程也会出现DNA损伤及染色质浓缩的现象，但与最早被提出的程序性细胞死亡过程——细胞凋亡(apoptosis)相比，它在发生机制及细胞形态都有很大的不同。

在机制方面，参与细胞凋亡过程的半胱氨酸蛋白酶(caspase)主要是caspase-3、caspase-8、caspase-6；而细胞焦亡在最初被定义为caspase-1依赖性的过程，后来的研究中发现caspase-11/4/5、caspase-3、caspase-8也参与到了细胞焦亡的非经典途径中[14]。此外，细胞焦亡又在2015年的一项研究中被称为gasdermin蛋白介导的程序性死亡[15]，说明gasdermin蛋白家族，尤其是gasdermin D(GSDMD)在焦亡中是必需的，发挥了执行者作用。它能够被caspase-1及caspase-11/4/5特异性切割为C-末端(C-GSDMD)和N-末端(N-GSDMD)裂解片段，随后N-GSDMD穿透细胞膜使其形成孔隙，导致细胞膜的穿孔，释放细胞内的促炎内容物[16]；而细胞凋亡时，细胞不会破裂及释放炎症因子，而是进行细胞内容物的包装及凋亡小体的非炎性吞噬摄取过程[17]。总的来说，细胞焦亡是一种炎症性的细胞反应，这一过程一般在细胞感应到潜在的损伤事件时发生，包括病原体相关的分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)、损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)、代谢水平改变以及环境刺激等[18]。

2 细胞焦亡发生的机制

2.1经典途径 细胞焦亡的经典途径是由caspase-1介导的炎症小体途径，能够由微生物或非微生物刺激激活，是先天免疫的重要组成部分[19]。细胞焦亡的经典途径是由炎症小体介导的。它们是一系列结构相似的大型多蛋白复合物的总称，较典型的炎症小体如NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2一般都包含三部分：①细胞溶质模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)，如NOD样受体(NLRs)及AIM2(ALR member absent in melanoma 2)样受体(ALRs)；②含有半胱天冬酶募集结构域(caspase recruitment domain，CARD)的凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein，ASC)；③caspase-1前体(pro-caspase-1)[20]。炎症小体中不同的PRRs能够识别相应的PAMPs或DAMPs后激活，在经历寡聚化后与激活的ASC及pro-caspase-1一同组装成为炎症小体[21-22]。炎症小体激活后被作为半胱氨酸蛋白酶caspase-1的激活平台，将caspase-1的前体裂解形成激活的二聚体形式。激活的caspase-1随后对gasdermin家族效应蛋白GSDMD进行切割[23]。GSDMD由N-端及C-端结构域组成，C端-结构域在分子中起到内在抑制剂的作用。一旦C-端结构域被切割，剩下的N-端结构域就会被激活释放，自由寡聚化并插入质膜中，形成10～14 nm的孔隙，导致细胞渗透压平衡的丧失，导致细胞焦亡[24]。此外，caspase-1还能使促炎因子白细胞介素-1β(IL-1β)及白细胞介素-18(IL-18)的前体(pro- IL-1β和pro- IL-18)裂解成熟后通过GSDMD形成的孔隙释放到胞外，加重炎症反应[25](图1)。

Canonical pathway:经典途径；Non-canonical pathway：非经典途径；DAMPs(damage associated molecular patterns)：损伤相关分子模式；PAMPs(pathogen-associated molecular patterns)：病原体相关的分子模式；LPS(Lipopolysaccharide):细菌内脂多糖；Death stimulation signal：死亡刺激信号；inflammasome：炎症小体；pro-caspase-1：半胱氨酸蛋白酶-1前体；pro-caspase-11：半胱氨酸蛋白酶-11前体；pro-caspase-3：半胱氨酸蛋白酶-3前体；caspase-11：半胱氨酸蛋白酶-11；caspase-3：半胱氨酸蛋白酶-3；caspase-1：半胱氨酸蛋白酶-1；pro-IL-18：白细胞介素-18前体；pro-IL-1β：白细胞介素-1β前体；IL-18：白细胞介素-18；IL-1β：白细胞介素-1β；GSDMD：Gasdermin D；GSDME：Gasdermin E。图1 细胞焦亡发生的途径 Fig.1 Pathways of pyroptosis

2.2非经典途径 焦亡的非经典途径主要是由caspase-11(在人类中为caspase-4/5)介导的，它与caspase-1同属于促炎caspase家族，具有相似的结构，但序列之间存在差异。这意味着它们在细胞焦亡的过程中通过不同的途径发挥着相似的作用。Caspase-11能够将N-尾端的CARD直接与革兰阴性菌细菌内脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)结合，从而变为激活态，随后切割裂解GSDMD生成N-GSDMD，最终形成质膜孔隙[26]。但与caspase-1不同的是，caspase-11无法直接裂解pro- IL-1β和pro- IL-18，它通过将GSDMD裂解后间接地激活NLRP3炎症小体启动NLRP3/caspase-1途径来介导IL-1β和IL-18的成熟与分泌[27](图1)。此外，过去认为凋亡相关的半胱氨酸蛋白酶caspase-3、caspase-8无法刺激gasdermin家族蛋白诱导焦亡。但近年发现肿瘤化疗药物能够作为死亡刺激信号诱导caspase-3 裂解gasdermin家族的另一种蛋白gasdermin E(GSDME)，形成N-GSDME，释放IL-1β，导致肿瘤细胞的焦亡，这一发现为化疗对癌症的作用机制提供了全新的思路[28]。并且在对乳腺癌相关的研究中也发现化疗药物如PD-L1能够诱导caspase-8将乳腺癌细胞的凋亡转化为GSDME依赖性焦亡[29]。此外，也有研究表明耶尔森氏菌感染能够诱导小鼠巨噬细胞中caspase-8相关的GSDMD裂解[30]。

3 缺血性卒中与焦亡的关系

大脑的缺血会造成脑组织的缺氧及葡萄糖供应不足，从而造成包括神经元死亡、脑水肿、血脑屏障损伤、神经功能障碍等一系列脑损伤事件[31]。从缺血性卒中发作的几分钟内，乃至后几天内的急性期，甚至几个月的损伤恢复期，都伴随着神经炎症的发生。脑损伤导致炎症因子的分泌，而炎症因子又反过来激活神经系统的常驻免疫细胞——小胶质细胞，并募集外周免疫细胞，加重神经炎症反应[32]。在缺血性卒中发作后损伤或死亡的细胞还会释放包括高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、腺苷三磷酸(ATP)及热休克蛋白等内源性物质的DAMPs，随后激活存在于先天免疫细胞表面或内部的PRRs，NLRs及Toll样受体(TLRs)等[33]。一些PRRs的激活使炎症小体在胞浆形成，诱导半胱氨酸蛋白酶如上述的caspase-1、-4/5/11活化后使炎症因子IL-1β和IL-18成熟，并通过激活GSDMD蛋白形成细胞膜孔，使炎症因子释放，由此造成细胞的焦亡[34]。

由于介导焦亡炎症小体组成部分之一——PRRs主要表达在小胶质细胞及星形胶质细胞等免疫细胞上介导先天免疫反应，故在缺血性脑卒中后引起的细胞焦亡也主要发生在小胶质细胞及星形胶质细胞中[35-36]。一项研究表明在脑缺血/再灌注的小鼠模型中出现里显著的小胶质细胞焦亡，而焦亡关键执行蛋白GSDMD基因的敲除导致小胶质细胞焦亡程度显著降低并降低了全脑的神经炎症水平，预示了小胶质细胞在脑缺血后焦亡及炎症中的重要作用[37]。除小胶质细胞外，以往研究MCAO体内模型及OGD体外模型中都证实了星形胶质细胞中细胞焦亡的程度显著增强；并且有报道表明星形胶质细胞中的细胞焦亡严重损害了血脑屏障的完整性并对星形胶质末端淋巴系统中水通道蛋白-4(aquaporin-4，AQP-4)介导的脑内Aβ-(amyloid-beta peptide，Aβ)的清除过程产生不良影响，从而使缺血后脑内稳态失衡，并容易造成卒中后的痴呆[38]。

许多研究中都说明了细胞焦亡过程与缺血性卒中的密切联系。炎症小体作为焦亡通路中的关键蛋白，密切参与了细胞焦亡启动及神经炎症发生过程，POH等[39]在小鼠大脑中动脉闭塞/再灌注(MCAO/R)模型中检测了NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2四种典型炎症小体的状态及相关炎性组分的表达，并且在BV2小胶质细胞体外缺氧缺糖(OGD)模型敲除BV2细胞中的NLRC4基因或使用caspase-1、caspase-8的抑制剂对小胶质细胞凋亡及焦亡的情况进行了进一步验证，结果显示小胶质细胞中炎症小体及其相关炎症组分如IL-1β及IL-18表达显著上升，而NLRC4基因的敲除及caspase-1、caspase-8抑制剂的干预能够抑制炎性组分的活化，防止小胶质细胞的凋亡及焦亡；此外，神经炎症的重要调节分子——在髓细胞上表达的触发受体(TREM)-1能够通过与脾酪氨酸激酶(SYK)相互作用而激活促炎通路CARD9/NF-κB和NLRP3/caspase-1，并上调小胶质细胞中GSDMD、GSDMD-N的表达，促进细胞膜孔形成并释放炎症因子，从而导致小胶质细胞的焦亡[40]。除了对小胶质细胞焦亡的研究外，在针对MCAO大鼠及神经细胞OGD模型的实验中发现长链非编码RNA母源表达基因-3(MEG3)，miR-485及AIM2炎症小体的互作通路通过激活caspase-1介导了脑缺血后的神经元细胞焦亡[41]。这些研究说明通过靶向细胞焦亡的各关键分子来治疗缺血性卒中可能是一个十分可行的策略。

4 细胞焦亡过程作为潜在的缺血性卒中治疗靶点

在目前的临床实践中，早期溶栓及动脉取栓被认为是治疗缺血性卒中最有效的方法，但大部分患者因错过时间窗或合并禁忌证而失去早期治疗机会，故目前临床对缺血性卒中仍主要以抗血小板聚集、抗凝、神经营养、神经保护剂等药物治疗为主[42-43]。由于细胞焦亡在缺血性卒中中扮演了重要的角色，这使得细胞焦亡相关的各个关键节点成为了潜在的缺血性卒中治疗靶点。

4.1靶向炎症小体 炎症小体是细胞焦亡经典途径启动的关键复合物。大量的文献显示很多药物能够通过干预炎症小体而对缺血性卒中产生治疗作用。例如，一种新型化合物JLX001能够缩小MCAO大鼠的脑梗死面积，改善缺血性脑损伤，并抑制NLRP3炎症小体相关蛋白的表达，使促炎细胞因子IL-1β水平降低，并增加抗炎表型小胶质细胞的数量[44]。生姜中提取的一种天然产物6-姜酚被证明能够通过显著降低NLRP3炎症小体介导的神经炎症水平和神经元凋亡，并上调自噬，从而减轻脑缺血/再灌注后造成的损伤[45]。随着研究的深入，研究者们发现一些传统药物也能够通过抑制炎症小体介导的细胞焦亡过程产生疗效。注射用丹酚酸已被我国食品药品监督管理局批准用于临床缺血性卒中的治疗，MA等[46]的研究表明其能够通过促进小胶质细胞促炎M1表型向抗炎M2表型转换及抑制NLRP3炎症小体/细胞焦亡轴发挥神经保护作用。此外，SHE等[47]的研究表明补阳还五汤的主要药效成分黄芪总皂苷能够显著改善MCAO大鼠的神经功能障碍及神经元损伤，并显著抑制NLRP3/caspase-1介导的细胞焦亡经典途径。人参皂苷Rd及当归提取物Z-藁本内酯合用能够显著抑制BV2小胶质细胞体外OGD模型的NLRP3炎症小体激活及细胞焦亡过程[48]。上述研究都证明了靶向炎症小体-细胞焦亡过程能够有效地改善神经炎症及缺血性脑损伤，具有很大的治疗潜力。

4.2靶向半胱氨酸蛋白酶caspase 半胱氨酸蛋白酶caspase家族是细胞死亡与炎症反应的重要参与者，它在以往的研究中已经成为缺血性卒中的治疗靶点，研究较多的主要是caspase-3/8、caspase-9及caspase-12。缺血性卒中的神经保护剂丁苯酞及依达拉奉在临床上应用广泛，它们的联用能够通过降低细胞损伤及caspase-3介导的细胞凋亡，增加神经元和血管内皮细胞的数量，减少星形胶质细胞的形成，从而减少MCAO小鼠的脑梗死体积和神经功能缺损，发挥多靶点作用[49]。另一项研究表明葡萄籽原花青素能够通过抑制caspase-12减轻MCAO小鼠缺血后诱发的细胞凋亡，具有治疗缺血性卒中的潜力[50]。我国的名方片仔癀也被报道能够显著降低caspase-3和caspase-9的表达，减轻神经元凋亡及缺血后的神经炎症[51]。近年来，许多更进一步的研究将caspase家族与细胞焦亡联系起来，其中caspase-1及caspase-11分别介导了细胞焦亡的经典与非经典途径。已有报道在小鼠脑缺血模型中证明了caspase-1的药理抑制剂Vx765能够通过下调 caspase-1的表达显著降低细胞焦亡过程中各关键分子的激活水平，并显著缩小脑梗死体积，恢复模型小鼠的认知与行为功能[52]。经典的抗癫痫及抗躁郁药物丙戊酸也被研究证实其通过调节半胱氨酸蛋白酶补充域[32]/caspase-1/IL-18，IL-1β途径抑制神经细胞的焦亡，产生神经保护作用[53]。此外，通心络被证实能够下调caspase-11及caspase-1，缓解MCAO大鼠缺血脑组织星形胶质细胞的细胞焦亡，并减少细胞周围Aβ的积聚，对脑组织产生保护作用。

4.3靶向执行蛋白GSDMD gasdermin家族蛋白，特别是GSDMD在细胞焦亡过程中扮演着执行者的重要作用，它能够在裂解后使细胞穿孔，以释放胞浆中的炎性介质。WANG等[37]研究发现，将MCAO小鼠的GSDMD 基因敲除后能够有效抑制小鼠脑中小胶质细胞IL-1β及IL-18的分泌，抑制缺血区周围细胞焦亡，改善损伤的神经功能，说明下调GSDMD的表达可能称为缺血性卒中治疗的潜在策略。中药石斛中提取的有效成分之一石斛生物碱被报道具有抗氧化、抗炎及抗真菌活性，一项研究表明石斛生物碱在体内及体外缺血模型中均能够通过降低焦亡相关蛋白Caspase-1和GSDMD的表达，并下调炎症因子IL-1β、IL-6和IL-18，从而抑制细胞焦亡及神经炎症反应，发挥脑保护作用[54]。中药姜黄中最主要的有效成分姜黄素被报道能够通过抑制线粒体凋亡和内质网应激以及刺激神经发生而对脑产生保护作用，RAN等[55]研究进一步表明姜黄素能够显著改善MCAO小鼠卒中后的脑白质损伤，并显著降低脑中caspase-1、GSDMD阳性的小胶质细胞数量，有效抑制细胞的焦亡。LI等[56]的研究基于大鼠MCAO/R模型及PC12细胞的体外OGD模型探究了临床一线用药阿司匹林、吲哚布芬分别与氯吡格雷、替卡雷洛联用对缺血性脑损伤的保护作用，结果表明两类抗血小板药联用时能够比单药更显著地改善模型组的缺血损伤状态，并通过干预 NF-κB/NLRP3信号通路，显著降低NLRP3，Caspase-1，IL-18，IL-1β及GSDMD的表达，抑制神经炎症与细胞焦亡相关因子的水平，为传统的缺血性卒中用药方案增添了全新的机制阐释[57]。虽然目前为止还没有特定的GSDMD抑制剂用于治疗缺血性卒中，但越来越多的实验研究表明GSDMD十分有希望成为未来缺血性卒中的治疗靶点。

5 结束语

目前对于缺血性卒中的研究大多集中于兴奋性毒性、氧化应激及神经炎症等领域；对于脑缺血后细胞死亡的研究也大多聚焦于细胞凋亡、坏死及自噬过程。现行治疗缺血性卒中的首选临床疗法仍是采用静脉溶栓、机械取栓或使用抗血小板药物等方法恢复脑血流；虽然对于缺血性卒中的发生和进展机制已有较为深入和广泛的研究，但作用于上述机制的特异性药物转化进入临床实践的比例却并不乐观，其主要原因是缺血性卒中的发生涉及到神经、免疫等多个系统的相互作用，针对某一特定通路或蛋白的药物其靶向性不足，易产生其他系统的非特异性结合而导致广泛的不良反应；同时由于缺血性卒中的发生及进展是全身多个系统共同作用的复杂结果，针对单一通路或蛋白的药物难以全面的纠正多系统的损伤与紊乱；此外，一些药物在动物及细胞实验上缺少稳定的效果，实验的可重复性不强，这增大了其从临床前实验转化至临床阶段的难度。

细胞焦亡最初于感染性疾病的进程中被发现，后在其他与炎症相关的非感染性疾病中也证实了细胞焦亡过程的关键作用，它作为与炎症密切相关的细胞程序性死亡方式成为了沟通细胞死亡及免疫炎症途径的一座桥梁，为缺血性卒中这样同时存在器质性损伤及免疫激活反应的疾病提供了新的潜在治疗思路。缺血性卒中的疾病发展过程中，细胞焦亡一方面造成了脑内神经元及免疫细胞的丢失，引起神经缺损及大脑功能的损害；另一方面，焦亡过程最终导致胞内炎症因子的释放，使脑内小胶质细胞及星形胶质细胞不断激活，并且造成外周免疫细胞在脑中的浸润，加重炎症反应，进一步对大脑造成损伤，形成恶性循环。所以，靶向细胞焦亡通路中的关键蛋白可能在减少脑部实质损伤的同时降低脑内炎症水平，改善缺血性卒中后造成的神经损伤。总之，细胞焦亡作为一种新型细胞死亡方式，可能作为治疗缺血性卒中的潜在靶点。

然而，细胞焦亡的相关研究仍处于实验室阶段，并且缺少相关通路蛋白的特异性抑制剂用于进一步的机制研究。此外，细胞焦亡与缺血性卒中其他机制之间的关系仍未完全阐明，需要更多的研究将细胞焦亡与传统的作用通路联系起来，以期开发出多通路、多靶点的缺血性卒中新疗法，达到提高治愈率，改善预后的效果。