高婷婷 孙天奇 刘鑫鑫 任延玲 邱业峰 王 进 侯 婷 袁 征 张 涛

(军事医学研究院实验动物中心，北京 100071)

垫料是实验动物直接接触的微环境因素，是影响实验动物健康、福利和动物实验结果的国际公认的重要环境条件之一[1-2]。它不仅能满足啮齿类动物啃咬、做窝的生活习性，还能吸附排泄物，降低笼内氨气浓度，保持笼内环境干燥，抑制有害细菌生长，起到维持饲养笼具和环境清洁卫生的作用[3-6]。但目前仅河北、江苏地区的地方标准对实验动物垫料质量做了要求。实验动物垫料多种多样，既有自然材料也有人工材料[7]。研究显示，实验动物日常饲养管理中,采用玉米芯替代刨花后,可以适当延长换窝间隔,但具体使用量不明确[8-9]。相同换笼周期下，理论上认为垫料使用量越多，其功效越好，对实验动物生长因素的影响越小，但会增加成本和工作量。而垫料使用量太少不利于实验动物健康和福利，且换笼周期对笼盒内洁净度有较大影响。在符合标准的最大饲养密度下，国内实验动物机构大鼠、小鼠换笼周期多为7～14 d[8]，国外多为14～21 d[10]。为了确定屏障环境内IVC系统饲养的大鼠、小鼠笼盒玉米芯垫料的适宜使用量及其换笼周期，本研究对此进行了初步探讨。

1 材料和方法

1.1 实验材料

玉米芯颗粒垫料直径6～8 mm，购自欣淼木材加工有限公司；IVC小鼠笼盒尺寸(宽×深×高)0.43×0.165×0.174 m，IVC大鼠笼盒尺寸(宽×深×高)0.461×0.274×0.228 m，均购自泰尼百斯公司。

1.2 实验动物

8周龄C57雌性小鼠45只，8周龄SD雌性大鼠27只，均购买于北京斯贝福生物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2019-0010。此实验经实验动物管理与使用委员会审核，编号：IACUC-DWZX-2018-302。

1.3 屏障环境条件及IVC主机参数

大鼠和小鼠饲养于实验动物中心动物房内，设施许可证号：SYXK(军)2017-0022。环境温度23～26 ℃，湿度45%～70%，通风换气量≥20次/h，主机通风换气次数75次/h，饲养架为泰尼百斯蓝线NEXT系列TN144型和HN36型。

1.4 方法

1.4.1实验分组：按照饲养垫料的使用量，实验分为低垫料组、中垫料组和高垫料组。C57小鼠饲养于小鼠笼盒内，随机分为3组，分别为Mouse低、Mouse中、Mouse高，每组5只，组间3个重复。SD大鼠饲养于大鼠笼盒内，随机分为3组，分别为Rat低、Rat中、Rat高，每组实验动物3只，组间3个重复。小鼠、大鼠笼盒垫料使用量按表1添加。

表1 小鼠、大鼠笼盒垫料使用量Table 1 The amount of pad material used in mouse and rat cage

1.4.2体质量：将实验动物放入笼盒内时分别对其初始体质量进行称重、记录，在饲养过程中，每3天进行一次称重并记录，连续记录21 d。

1.4.3采食量：将实验动物放入笼盒内时，分别称取对应相同质量的饲料(±0.1 g)置于笼盒饲料架上，其中小鼠实验组分别称取200 g，大鼠实验组分别称取400 g。实验开始后，每3天称量饲料架上的剩余饲料量后，再分别添加新鲜饲料(小鼠实验组200 g，大鼠实验组400 g)，记录实验动物每3天的采食量，连续记录21 d。

1.4.4粪便量：将干净底盒装入垫料后称重，即为初始重量，实验期间不更换笼盒和垫料，每3天称量1次笼盒带垫料的重量，连续记录21 d，计算粪便量(g)=实验天称量重量(g)-初始重量(g)

1.4.5笼盒污染评价：通过肉眼对垫料的色泽和粪便的污染比例进行评分，从而对垫料的污染情况做出评价。干净垫料记为0分，污染越重分值越高，污染最严重的垫料记为5分。根据每日粪便量的多少、垫料的污染情况评分，总分5分。实验结束时垫料的污染情况记为5分。每3天拍照记录垫料污染情况，连续记录21 d。

1.4.6统计方法：利用GraphPad Prism 5软件进行统计学处理及作图，组间采用方差分析。

2 结果

2.1 垫料使用量对体质量的影响

由图1可知，各实验组小鼠体质量随着饲养天数的增加呈上升趋势，但无统计学差异。3个实验组小鼠平均初始体重17.5 g，实验前3天体增重8%。3 d后体质量增长趋势变缓，每3天平均体增重2.5%。15～21 d，Mouse中组体质量高于其他2组，但无统计学差异。

图1 不同实验组小鼠的体质量变化Fig.1 The weight changes of mouse

由图2可知，各实验组大鼠体质量随饲养天数的增加呈上升趋势，但无统计学差异。3个实验组的大鼠平均初始体质量为198 g，实验前3 d体增重5%，3 d后体质量增加趋势变缓。3～21 d，Rat低组体质量低于其他两组。18 d时Rat高组体质量高于其他两组，但无统计学差异。

图2 不同实验组大鼠的体质量变化Fig.2 The weight changes of rats

2.2 垫料使用量对采食量的影响

由图3可知，实验过程中各实验组小鼠的采食量变化趋势较一致，但无统计学差异。实验前3 d，3个实验组小鼠每只采食量平均10 g左右。3～12 d，各实验组小鼠采食量减少，平均每3 d采食量减少7%。12～18 d，各组采食量增加，且18 d时采食量在10 g左右，18 d后各组采食量减少。

图3 不同实验组小鼠的采食量变化Fig.3 The feed intake changes of mouse

由图4可知，实验过程中各实验组大鼠采食量变化趋势较一致，但无统计学差异。实验前3 d，各实验组大鼠每只采食量平均在38.6 g左右。3～9 d，各组采食量增加，Rat低组采食量低于其他2组。9～21 d，各组采食量呈下降趋势。

图4 不同实验组大鼠的采食量变化Fig.4 The feed intake changes of rats

2.3 垫料使用量对粪便量的影响

由图5可知，实验过程中各组小鼠粪便量前6 d较为一致，每只小鼠每3 d粪便量平均约为5 g。9～21 d，Mouse中组的粪便量高于其他2组，Mouse低组的粪便量低于其他2组，但各组之间无统计学差异。

图5 不同实验组小鼠的粪便量变化Fig.5 The fecal weight changes of mouse

由图6可知，实验过程中各组大鼠粪便量变化趋势一致，且前6 d变化较小。每只大鼠每3 d粪便量约为18 g。6～21 d,Rat低组粪便量低于其他2组，各组之间无统计学差异。

图6 不同实验组大鼠的粪便量变化Fig.6 The fecal weight changes of rats

2.4 垫料洁净度评价

图7显示了小鼠不同垫料清洁度对应的评分标准。第0天小鼠干净垫料的评分记录为0分，粪便量仅在垫料中占2%左右记录为1分；粪便量的堆积占据饲养笼盒内一角(明显)记录为2分；粪便量的堆积占据饲养笼盒内两角(明显)记录为3分；粪便量的堆积占据饲养笼盒内两角且中间零散分布部分粪便(明显)记录为4分；粪便量的堆积占据饲养笼盒内两角且中间零散分布粪便占笼盒面积的50%(明显)记录为5分。

图7 小鼠不同垫料清洁度对应的评分标准Fig.7 The scoring standard corresponding to cleanliness of different bedding materials in mice

由图8可知，各实验组小鼠垫料洁净度第6天均达到2分，且无统计学差异。6～21 d，Mouse高组垫料洁净度评分低于其他2组，且9 d后Mouse高组与Mouse中组差异显著(P<0.05)，12 d后，Mouse高组与Mouse低组差异显著(P<0.001)。Mouse低组与Mouse中组洁净度9 d时接近3分，Mouse高组洁净度21 d达到3分。

图8 各实验组小鼠的垫料洁净度变化Fig.8 The changes of bedding cleanliness of mice in each experimental group

图9显示了大鼠不同垫料清洁度对应的评分标准。第0天大鼠干净垫料的评分记录为0分，粪便量仅在垫料中占10%左右记录为1分，粪便量的堆积占据饲养笼盒面积的30%左右记录为2分；粪便量的堆积占据饲养笼盒面积的50%左右记录为3分；粪便量的堆积占据饲养笼盒面积的70%左右记录为4分；粪便量的堆积占据饲养笼盒面积的90%(明显)记录为5分。

图9 大鼠不同垫料清洁度对应的评分标准Fig.9 The scoring standard corresponding to cleanliness of different bedding materials in rats

由图10可知，实验组大鼠垫料洁净度第6天时均达到2分，且无统计学差异；6～21 d，Rat中组洁净度评分高于其他2组，Rat高组洁净度评分低于其他2组，且均无统计学差异。12 d时，Rat中组与Rat高组差异显著(P<0.01)。Rat低组与Rat中组洁净度9 d时接近3分，Rat高组洁净度12 d时接近3分。

图10 各实验组大鼠垫料的洁净度变化Fig.10 The changes of bedding cleanliness of rat in each experimental group

3 讨论

垫料使用量和更换周期影响大鼠和小鼠的生活环境、动物福利甚至实验结果。而定期更换灭菌垫料是饲养过程中工作量较大的环节。大鼠和小鼠对环境变化比较敏感，日常垫料的更换工作，也会对其生理状态造成一定应激反应[11]。所以探讨合理的垫料使用量及换笼周期对规范实验动物饲养工作具有重要意义。目前常用垫料种类有刨花、木屑、秸秆、玉米芯、新型垫料、再生纸等，但由于原料成分混杂，来源不明，垫料质量控制尚未有明确国家标准和管理条例监管。刨花垫料在使用过程中粉尘量大，吸湿性能较差，采用7 d换笼时笼盒内微环境湿度较大，洁净度较差，且刨花分装时不利于饲养人员职业健康安全。改成玉米芯垫料后，粉尘量减少，吸湿性能好，且屏障环境内配备IVC系统，7 d换笼时笼盒内湿度正常，垫料洁净度较好。

本研究结果显示，大鼠和小鼠使用的3组垫料对体质量无明显影响，前3 d体质量增加较大可能是由于饲料适口性较好使采食量增加，从而促进体质量增加。这也与小动物改变生活环境后至少适应性饲养3 d需求相符合。研究结果显示，大鼠和小鼠不同垫料使用量对饲料采食量、粪便量无明显影响，说明3组垫料使用量没有对大鼠和小鼠造成明显的健康应激。垫料洁净度是直观反映是否需要更换笼盒的依据。在日常工作中，更换笼盒时一般笼盒内垫料洁净度评分在3分左右，在本研究中小鼠低垫料组和中垫料组在实验第9天时接近3分，高垫料组在第21天达到3分；大鼠低垫料组和中垫料组第9天达到3分，高垫料组第9天之后达到3分。动物房前期使用垫料量处于中垫料组，更换周期为一周一换。本研究结果表明，小鼠采用低垫料量的情况下，换笼周期可以调整至12 d一换，大鼠换笼周期调整至9 d一换，可以采用低垫料组，随着换笼周期的延长而增加垫料使用量，例如节假日，尤其是时间较长的节假日可调整为14 d换笼，但要增加笼内垫料使用量。此更换周期，减少大鼠和小鼠对环境敏感性的应激反应以及人员工作量，同时也大大减少动物房经济支出。

SPF级大鼠和小鼠都需饲养于屏障或隔离系统中，饲养模式有屏障系统、层流架、IVC、EVC、隔离罩等。IVC系统为采用微型隔离技术，通过独立通风系统向每个笼盒内部输送经过过滤的空气，获得洁净度在100级以上的大鼠和小鼠生活环境，且能够将各笼盒之间、笼盒与环境之间进行有效隔离开来，减少动物之间发生交叉污染几率，也能更好控制实验动物与工作人员之间感染的风险[12-14]。本研究中，大鼠、小鼠所处屏障环境温度23～26 ℃，湿度45%～70%，气流速度≤0.01，换气次数≥20次/h(定值，15次/h)，IVC系统通风换气次数75次/h。屏障环境为全新风系统，IVC主机送风为屏障环境内取风，所以屏障环境内的参数对大鼠和小鼠笼盒内的小环境有直接的影响。本研究选用玉米芯垫料，其自身吸水吸湿性能好，同时来自IVC系统的独立通风换气，使笼盒内洁净度在短期饲养内评分较低，延长笼盒换笼周期，减少大鼠和小鼠的环境适应性。

综上所述，本研究探讨了SPF级大小鼠在标准IVC饲养系统中玉米芯垫料的合理使用量，证实不同垫料使用量对大鼠和小鼠体质量、饲料采食量、粪便量、洁净度无明显影响。研究结果可为制定相关玉米芯垫料使用量标准或大鼠和小鼠更换笼盒周期提供参考。