李晴晴 黄 菊 张小凤 王月月 聂文虎 耿志军 鲍云溪 宋 雪

1 蚌埠医学院第一附属医院中心实验室，安徽省蚌埠市 233004；2 蚌埠医学院科研中心组织移植安徽省重点实验室； 3 蚌埠医学院第一附属医院检验科

髓母细胞瘤(Medulloblastoma，MB)是颅内胶质瘤的一种，恶性程度最高，多发于14岁以下的青少年，是死亡率较高的一类恶性肿瘤[1]。全反式维甲酸(Retinoic acid，RA)因其生物利用度高、低毒性而更适宜于儿童髓母细胞瘤的治疗，但部分MB却存在对RA敏感性不佳的问题[2]。根据生物学及遗传学的异质性，MB分为具有明显特征性基因变化的4个亚型：SHH型、WNT型、G3型和G4型，其中G3型恶性程度最高，对抗肿瘤药物的敏感差，易导致患者预后不佳[3-4]。研究发现甲基化抑制剂5-氮胞苷可以改善MB的肿瘤细胞对RA的敏感性[5]。传统的甲基化抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷由于毒性较强而不适宜于儿童髓母细胞瘤的治疗[6]。白藜芦醇(Resveratrol，Res)是一种多酚类化合物，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化等多种生物学活性[7-8]。研究发现Res在极低的药物浓度下仍对抑癌基因有较强的去甲基化作用[9]。在此基础上，本研究通过离体与在体实验相结合，证实Res是否通过提升MB对RA的药物敏感性，并揭示Res影响RA药物敏感性的调控机制。

1 材料和方法

1.1 细胞培养及处理 以每毫升5.0×104个细胞的浓度在培养皿中(100mm)分别接种Med-3、UW228-2、UW228-3细胞，当细胞生长至对数期时，弃去原有的培养液，更换10ml新鲜培养液，同时按照分组加入相应浓度的药物，Res(Sigma,Cat#∶R5010)：25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L；RA(Sigma，Cat#∶R2625)：2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L；Res与RA；正常培养的细胞设为对照组(Control组)；轻轻摇匀后置于孵箱中培养。药物持续作用72h后，收集各组细胞于Ep管中并保存在-80℃冰箱中。

1.2 MTT 通过3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基-四唑溴化物(MTT，Sigma，Cat#∶CT02)测定来确定药物对细胞增殖的影响。处理后的细胞与MTT共孵育3h，使用DMSO(Sigma，Cat#∶D2650)溶解，酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其OD值。

1.3 HE染色 利用细胞爬片或组织切片进行HE染色，苏木素染核5min，自来水洗涤；然后进行分化数秒，自来水洗涤；再用伊红染细胞质5min，自来水洗涤，脱水固定。使用中性树胶封片，自然晾干后使用显微镜观察肿瘤细胞的形态和数量变化。

1.4 TUNEL检测 根据标准方案脱蜡并水化组织切片，将载玻片置于含有柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)的塑料盒中，施加350W微波辐射5min。采用PBS冲洗载玻片2次，待样品周围干燥，在样品上加入50μl TUNEL反应混合物(Roche，Cat#∶11684795910)，37℃避光孵育60min，注意保持载玻片的湿润。用PBS冲洗载玻片2次，滴加DAPI染色，在荧光显微镜下分析样品。

1.5 动物模型 利用脑定位仪和颅骨钻机在裸鼠颅骨垂直打孔(矢状缝右侧2mm，人字缝后2mm)，将UW228-2细胞(1×106个)移植入裸鼠的小脑右侧半球，构建裸鼠髓母细胞瘤原位移植模型。通过腹腔给药：对照组(等量生理盐水)、Res单独给药组(300μmol/L，0.1ml)和RA单独给药组(100μmol/L，0.1ml)及Res与RA联合给药组，联合给药的顺序为：先进行腹腔注射RA，5min后再给予Res。2d给药1次，持续3周。在模型鼠出现发病特征(体重减轻，食欲不振，眼鼻黏膜出血，偏行或瘫痪)后密切观察，于濒死状态立即麻醉、脱颈处死裸鼠，记录生存时间。收集新鲜的组织样本，一部分液氮(<-180℃)冻存以制备蛋白、DNA、RNA，剩余部分保存于4%福尔马林溶液中，静置过夜。

1.6 MRI 在细胞植入裸鼠小脑半球后的第2天进行MRI监测以明确肿瘤细胞在裸鼠颅内的成瘤时间。待成瘤后将模型鼠平均随机分为四组：正常组(不进行任何处理)、Res治疗组、RA治疗组、Res联合RA治疗组。治疗干预后的第3天继续进行MRI成像监测(Bruker BioSpin MRI GmbH)，并PS软件测算肿瘤的最大横截面积。

1.7 免疫组化 对裸鼠原位瘤脑组织进行免疫组织化学染色，使用Ki-67抗体(1∶100；Abcam，Cat#∶ab16667)以确定肿瘤细胞内的增殖活性。经过二甲苯脱蜡、抗原修复、孵育一抗过夜、二抗孵育、DAB显色、染核、封片一系列操作，最后在显微镜下读片分析结果。

1.8 Western blot Western blot 用于检测肿瘤细胞内的CRABP2及RAR/RXR蛋白水平的变化和凋亡信号通路的活化程度。使用的一抗为Bax、Bcl2、caspase3、c-caspase3、CRABP2、RAR/RXR和β-actin(Abcam；1∶100；Cat#∶ab 243140；ab 32124；ab 32351；ab 32150；ab 181255；ab 231610；ab 8226),稀释比例为1∶800。

1.9 RT-qPCR RT-qPCR分析肿瘤组织的维甲酸代谢通路，提取肿瘤中的总RNA，通过扩增CRABP2、RAR/RXR的相关引物,评估其mRNA水平的变化。引物序列见表1。

表1 引物序列(5’to 3’)

1.10 统计学方法 通过SPSS17.0软件(SPSS Inc.，Chicago，IL)分析实验数据。通过独立样本t检验评估两组数据的统计学差异，并通过χ2检验评估分类数据。P<0.05时差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 体外研究

2.1.1 在体外白藜芦醇能够增强髓母细胞瘤对维甲酸的敏感性，抑制细胞增殖活性：MTT结果显示，经浓度10μmol/L的RA处理，Med-3细胞系显示其本身就对RA具有高敏感性。在此浓度下，Med-3细胞的增殖活性降低，细胞数量相较对照组明显减少(P<0.05)。而UW228-2、UW228-3细胞系在此浓度下(RA 10μmol/L)表现出对RA的低敏感性，细胞数量与对照组无明显差异(P>0.05)。但是三种细胞系经Res和RA联合给药处理后，细胞数量相对于单独给药组明显减少(P<0.05)，这表明Res可能增强了MB对RA的敏感性，抑制细胞增殖活性(图1a～c)。为了进一步论证此结论，我们选取对照组、单独给药组Res(12.5μmol/L)、RA(5μmol/L)以及Res与RA联合给药组的细胞爬片进行HE染色，结果显示联合给药组与对照组相比肿瘤细胞的形态发生神经元样改变，细胞数量显著减少(P<0.05)，见图1d。以上结果均表明Res能够明显增强MB对RA的敏感性，抑制细胞增殖活性，有效减少了细胞数量。

图1 白藜芦醇增强髓母细胞瘤对维甲酸的敏感性

2.1.2 在体外白藜芦醇能够增强维甲酸诱导的细胞凋亡：为了验证Res能否增强RA诱导的肿瘤细胞凋亡，选取对照组、Res(12.5μmol/L)、RA(5μmol/L)和Res与RA联合给药组处理过的MB细胞系(Med-3、UW228-2、UW228-3)进行TUNEL检测，结果显示单独给药处理组肿瘤细胞的凋亡数量较少，而联合给药组的肿瘤细胞凋亡数量显著增多(P<0.05)，此结果表明Res能够增强RA诱导的细胞凋亡(见图2)。后续实验考虑到低浓度Res对UW228-2细胞的增敏作用已然最佳，特选取低浓度Res和RA作为重点研究对象。这些实验结果都证明了Res与RA联合给药处理可明显诱导MB的凋亡。

2.1.3 白藜芦醇和维甲酸联合给药能够激活凋亡通路：为了探究Res是如何增强RA诱导的细胞凋亡，我们提取了药物处理后的细胞，利用Westerrn Blot检测细胞内凋亡信号通路的改变。选取MB细胞系(UW228-2)为重点研究对象，以β-actin为内参检测Bax、Bcl2、c-caspase3和caspase3蛋白。结果显示对照组与单独给药组的抗凋亡蛋白Bax表达量无明显差异(P>0.05)，而联合给药组的Bax蛋白表达量明显增加(P<0.05)，约为其他组的2.6倍；对于抗凋亡蛋白Bcl2的检测结果显示对照组与单独给药组的表达量无明显差异(P>0.05)，而联合给药组的表达量相对于其他组却显著降低(P<0.05)；另外，对照组和联合给药组的c-caspase3蛋白表达量无明显差异(P>0.05)，相对于联合给药组表达量明显降低，而联合给药组的c-caspase3蛋白表达量却显著上调(P<0.05)，见图3。以上结果均表明Res与RA联合给药能够激活凋亡通路，进而增强RA诱导的细胞凋亡。

图3 联合给药激活凋亡通路

2.1.4 白藜芦醇通过激活RA代谢通路增强维甲酸敏感性：我们的研究表明在体外Res与RA联合给药能够激活凋亡通路，那么Res是否凋亡激活RA代谢通路来增强其对RA的敏感性？于是我们通过Western Blot和RT-qPCR检测肿瘤细胞内的CRABP2及RAR/RXR的变化。Western Blot结果显示对照组与RA组相比，肿瘤细胞内的CRABP2表达无明显差异(P>0.05)，而Res组与联合给药组相比，CRABP2的表达虽无明显差异(P>0.05)，但这两组比对照组和RA组的CRABP2蛋白表达量增加(P<0.05)，这提示Res能够激活RA代谢通路(图4a～b)。此外，Western Blot检测结果还显示对照组与RA组细胞内的RAR/RXR表达量无明显差异(P>0.05)，而Res组和联合给药组与其他两组相比RAR/RXR的表达量均显著增多(P<0.05)，此结果提示Res增强了肿瘤细胞对RA的敏感性(图4c)。为了进一步证明此结论，我们进行RT-qPCR检测CRABP2及RAR/RXR的mRNA水平，其结果验证了Western Blot的趋势(图4d～e)。以上结果均表明在体外Res通过激活RA代谢通路增强RA敏感性。

2.2 体内研究

2.2.1 联合给药抑制了裸鼠颅内肿瘤的生长并延长生存时间：体外细胞实验结果已证明Res可能通过激活RA代谢通路增强RA敏感性，进而抑制细胞活性，减少了细胞肿瘤细胞数量。因此，我们构建裸鼠原位瘤模型来进一步证明Res对RA具有增敏作用。建模10d后对裸鼠的脑部进行核磁共振扫描，结果显示对照组、Res组和RA组小鼠的颅内肿瘤面积无明显差异(P>0.05)；而联合给药组肿瘤面积相对于其他组裸鼠颅内肿瘤生长较慢，肿瘤面积明显减少(P<0.05)，这些结果提示联合给药可能抑制了体内肿瘤细胞生长(图5a～b)。此外，我们还进行了组织病理学评估，对脑组织进行HE染色，结果表明对照组和单独给药组肿瘤细胞无明显的形态学变化，而联合给药组肿瘤内的坏死细胞较多(图5c)。同时，我们还对裸鼠原位瘤模型进行了生存时间分析，结果显示联合给药组的生存时间与其他组相比明显延长(图5d)。以上实验结果均表明联合给药通过抑制肿瘤生长进而改善模型小鼠的生存状况，延长裸鼠的生存时间。

图5 联合给药抑制裸鼠颅内肿瘤生长

2.2.2 联合给药诱导了裸鼠颅内肿瘤的凋亡并抑制增殖活性：为了验证联合给药是否诱导了裸鼠颅内肿瘤的凋亡并抑制增殖活性，我们对各实验组进行TUNEL检测，结果显示正常组和单独给药组凋亡细胞数量无显著差异(P>0.05)，而联合给药组与其他组相比凋亡细胞数量明显增多(P<0.05)，这表明联合给药诱导了裸鼠颅内肿瘤的凋亡(图6a～b)。此外，对肿瘤组织进行免疫组织化学染色来评估反映增殖活性的Ki67蛋白表达，结果表明正常组和单独给药组Ki67阳性细胞数量无明显差异(P>0.05)，细胞增殖活性强；联合给药组与其他组相比Ki67的表达显著下调(P<0.05)，提示肿瘤细胞增殖活性减弱(图6c～d)。通过以上实验证明了联合给药不仅诱导了裸鼠颅内肿瘤的凋亡并且还抑制肿瘤细胞的增殖活性。

图6 联合给药诱导颅内肿瘤凋亡

2.2.3 白藜芦醇可体内激活CRABP2通路增强维甲酸敏感性：由于体外细胞实验结果已证明Res可激活RA代谢通路增强RA的敏感性，而在体内是否与体外结果一致，为此我们选取对照组、单独给药组和联合给药组中的裸鼠颅内肿瘤组织，提取蛋白进行Western Blot和RT-qPCR实验，检测裸鼠颅内肿瘤细胞CRABP2及RAR/RXR的蛋白表达及mRNA水平。实验结果表明相对于对照组和单独给药组，联合给药组中的裸鼠颅内肿瘤细胞的CRABP2及RAR/RXR的表达均出现增强(P<0.05)，与体外结果一致，提示Res增强了肿瘤细胞对RA的敏感性(图7)。由此可以说明Res可在体内激活RA代谢通路进而增强RA的敏感性。

3 讨论

Res已被研究证实具有抗肿瘤的作用，是近年来的研究热点[7-8]。目前研究表明Res通过多种途径发挥抗肿瘤的作用：抑制细胞色素酶、诱导解毒酶、抑制环氧合酶、抑制蛋白激酶、诱导肿瘤细胞分化、促细胞凋亡等，并且Res的抗肿瘤机制十分复杂，可能是几种途径联合发挥抗肿瘤作用[10]。同时，研究发现Res针对不同的肿瘤细胞类型发挥作用的时间、浓度也有差异，即不同类型的肿瘤细胞对Res的敏感性各不相同[8,11]。有研究表明Res能够上调CRABP2及RAR/RXR的表达，证明了Res具有通过上调CRABP2，增强肿瘤细胞对RA敏感度的潜力[12-13]。此外，由于Res具有多种生物学功能，并且已有研究证明其无毒性，在人体测试剂量范围内对人体没有毒害[14-15]。因此，在多种疾病的治疗中Res作为治疗药物或辅助治疗药物均得到广泛应用。

RA作为促分化剂在临床已广泛应用，可激活下游维甲酸反应元件，启动凋亡通路相关基因的转录和表达，继而引发肿瘤细胞的凋亡[16]。于是我们基于Res具有抗肿瘤的功能及安全性较高两个特性，设想Res与RA联合给药的方式在MB的治疗中是否能起到提高肿瘤细胞对RA敏感性的效果。对此，我们进行实验研究并发现了Res对RA敏感性的调控。结果发现：Res可增加低敏感型髓母细胞瘤细胞系(UW228-3、UW228-2)对RA的敏感性。进一步探索发现，UW228-2、UW228-3经低剂量Res处理72h后，肿瘤细胞内CRABP2及其胞内受体RAR/RXR的表达出现增强。Res可能通过增加MB对RA的敏感性从而提高抗肿瘤效果，而Res通过激活RA代谢通路进而增强RA的敏感性是其可能作用的途径。

虽然我们的研究初步证明了Res通过激活CRABP2凋亡通路进而增强RA的敏感性，促使RA诱导细胞凋亡，但Res是否作用于其他信号转导通路，进而增强了RA的敏感性并抑制肿瘤细胞增殖，这是我们值得继续深入探究的问题。后期对Res与RA联合给药对抗髓母细胞瘤的作用途径需进一步阐明，为MB的临床治疗方案选择以及为改善患者的生存质量提供理论依据。