任静静 王珊珊 郭战萍

河南省新乡市中心医院 453700

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是常见的中枢神经系统退行性疾病，大量文献显示PD与遗传因素密切相关，且GBA、LRRK2是重要的生物标志物[1-3]。临床研究提出LRRK2突变与散发型PD存在密切联系[4]。Gan-Or Z研究显示在犹太人中携带 GBA 突变使其发展为PD的危险性增加13倍[5]。但目前关于上述生物标志物对PD的病情评估的报道较少，且关于即携带LRRK2 G2385R又携带GBA L444P PD患者的临床过程和特征尚未报道，本实验检测LRRK2 G2385R、GBA L444P双基因型突变分布情况，探讨LRRK2 G2385R和 GBA L444P突变对PD疾病临床表型的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2017年4月—2019年1月在我院诊疗的PD患者416例，其中男199例，女217例，所有PD患者均符合英国帕金森病协会脑库诊断标准，年龄40～80岁，排除由药物、创伤、脑血管病等诱发的PD以及有PD家族史者，排除躯体和器质性病变以及除PD外其他神经系统疾病。

1.2 LRRK2 G2385R和GBA L444P检测

1.2.1 提取DNA：抽取2ml空腹静脉血至 EDTA-Na2抗凝管，于-20℃冰箱保存，采用上海百傲科技股份有限公司血液基因组DNA提取试剂盒，按操作步骤提取DNA。

1.2.2 LRRK2 G2385R多态性测定：根据NCBI及ensembl基因库中LRRK2 G2385R所在的DNA序列，设计上游引物：5’-TTGCTAAGCAAAATAGCCCTG-3’和下游引物5’-GTAATGCTTCTCAGCACCATCTT-3’。 PCR 反应体系 25μl。反应条件：94℃ 5min，再94℃ 30s，61℃ 45s，72℃ 60s，共30个循环后，72℃ 5min 终止反应。PCR产物纯化后转移到专用孔板进行测序反应，引物同上浓度稀释10倍，反应体系10μl，反应条件：96℃ 1min，再96℃ 10s，50℃ 5s，60℃ 4s，共25个循环后，60℃ 4min 终止反应。纯化测序产物后在3500DX Genetic Analyzer仪器上检测基因序列。扩增试剂、测序试剂及纯化试剂均采用美国应用生物系统公司。

1.2.3 GBA L444P多态性测定：上游引物5’AATTGGGTGCGTAACTTTGTC-3’和下游引物5’-CAATGGTGAGGTGGGAAGT -3’，其余同上。

1.3 统计学方法 应用 SPSS20.0软件统计学分析数据，计数资料采用Fisher 精确检验，计量资料采用F检验。P<0.05差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 LRRK2基因G2385R位点及GBA基因L444P位点序列测定 详见图1、2。

图1 GBA杂合突变测序图

图2 LRRK2杂合突变测序图

2.2 研究对象的LRRK2 G2385R及GBA L444P多态性分布 本实验研究对象中检测出32例LRRK2 基因 G2385RG/A的杂合子突变(突变率7.69%)，8例GBA 基因 L444PT/C的杂合子突变(突变频率1.92%)，4例携带LRRK2 G2385R及GBA L444P双基因突变(突变率0.96%),均未检测出基因纯合突变。

2.3 一般资料 根据上述2个基因检测结果分为4组：仅携带LRRK2 G2385R突变的LRRK2-PD组、仅携带GBA L444P突变的GBA-PD组、携带LRRK2 G2385R和 GBA L444P双基因突变的LRRK2-GBA-PD组和未携带LRRK2 G2385R或 GBA L444P突变的MNPD组，在性别上4组间差异无统计学意义(P>0.05)。首发年龄LRRK2-PD组明显晚于GBA-PD组、LRRK2-GBA-PD组和MNPD组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 4组患者一般资料对比

2.4 4组患者的临床特征 4组在震颤为首发症状的差异无统计学意义(P>0.05)。LRRK2-PD组、GBA-PD组、LRRK2-GBA-PD组和MNPD组在疾病的分级、睡眠障碍、痴呆方面的差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 4组患者临床特征对比[n(%)]

3 讨论

PD是以震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态异常等常见的临床特征，也可伴睡眠障碍、痴呆并发症等。PD多发于老年，确切病因尚未清楚，有相关研究指出，其病因与发病机制可能与遗传、环境及衰老等因素有关[6]，但鲜有报道多基因位点对疾病进展的预测，为此本研究采用一代测序检测我院416例PD患者的LRRK2 G2385R、GBA L444P突变情况，探讨LRRK2 G2385R和 GBA L444P突变对PD临床表型的影响。

本实验检测出36例LRRK2 基因 G2385RG/A和12例GBA 基因 L444PT/C且均为杂合突变。这与相关学者报道的大陆，台湾变异频率基本一致[7-10]。验证了LRRK2 G2385R、GBA L444P相关PD易感基因为国内PD人群中常见的基因突变类型。本实验携带GBA基因L444PT/C突变率为1.92%，突变率较低提示除此易感基因外，可能存在其他因素修饰并参与PD疾病的发生。近年来，随着科研人员在基因方面研究不断地深入，发现基因多态位点的相互作用可以导致许多疾病患病风险[11]，本次研究首次检测出发现4例既携带LRRK2 G2385R又携带GBA L444P突变的PD患者，提示PD也存在多基因位点的相互作用。

进一步分析LRRK2 G2385R、GBA L444P突变与临床表型的相关性，笔者发现LRRK2-PD组、GBA-PD组、LRRK2-GBA-PD组和MNPD组在性别上无显著差异，这不同于Wang C等[12]提出的内地PD 患者LRRK2 基因突变携带者以男性居多，也与之前研究显示携带 GBA 基因突变PD 患者在男性中居多的结果不一致[13]，考虑这是由于不同样本量问题造成误差和偏倚的结果。在起病年龄方面，LRRK2-PD组较其他组的起病年龄明显晚，这与相关研究相同[14]；说明LRRK2突变影响PD的发病时间。4组在震颤为首发症状上并无统计学差异，也与之前的研究吻合[15]，这指示出震颤是PD的常见的首发表现，个体差异性不大。LRRK2-PD组与其他组相比症状较重进展较快且更易出现睡眠障碍、痴呆，这与报道的携带LRRK2 G2385R的患者日常生活能力和轴性症状的进展较快、睡眠障碍进展更迅速、认知功能差的结论一致[16]。说明携带LRRK2突变的PD病例进展快症状重且倾向出现睡眠及认知障碍的并发症，这在临床试验的分层研究中意义重大，可通过LRRK2 G2385R突变来预测PD个体化进展转归。携带GBA 基因突变组者并没有出现之前国外研究报道的明显年轻化[17]，这些结果的差异可能与人群环境不同有关，同时需要今后扩大样本量进一步验证。实验还惊奇发现LRRK2-GBA-PD组即携带LRRK2 G2385R又携带GBA L444P PD患者没有出现睡眠障碍、痴呆等症状；且与LRRK2-PD组相比疾病严重分级更低，与MNPD组相比不易出现痴呆，并没有出现理论假设的双突变患者症状表现更严重的。这可能意味着GBA L444P突变与LRRK2 G2385R突变并没有协同作用而具有反向相关性。即GBA L444P突变对携带LRRK2 G2385R PD患者有一定的阻止疾病恶性进展的保护作用。但由于本实验的LRRK2-GBA-PD的稀缺及疾病本身会受多因素的影响，需要进一步扩大样本量排除多因素的干扰来验证该结论，进一步深入了解GBA L444P基因突变可能有助于研发干预疾病发展的手段。

综上所述，携带LRRK2 G2385R突变 PD患者的首发年龄晚、但病程进展快、有较高的睡眠障碍和痴呆率，可作为预测PD的进展转归。GBA L444P基因突变对携带LRRK2 G2385R突变的PD患者有一定的保护作用，GBA L444P基因突变可能在延缓PD进展方面起重要作用。