杨 春，乔凤昌，孟露露，张翠平，许争峰*

(1.常州市第二人民医院妇产科,常州 213000;2.南京医科大学附属妇产医院产前诊断中心,南京 210000)

Even-plus综合征(OMIM:616854)是一种常染色体隐性遗传病，是先天性脑部及骨骼等多系统发育异常较为罕见的类型。该病是由HSPA9基因变异所致[1]。HSPA9基因位于5号染色体长臂3区1带，全长约18kb，有17个外显子，在序列上高度保守，编码679个氨基酸构成线粒体蛋白。有研究显示，HSPA9不同位点的基因突变可导致帕金森病、骨髓异常增生综合征、急性髓系白血病、贫血、糖尿病心脏病、肿瘤等情况[2-6]。但其导致胎儿期组织器官发育异常的研究鲜有报道，目前全球范围内迄今为止仅有5例因该基因变异导致患儿发生组织器官发育异常的案例报道[7]，因此对此疾病的诊断缺乏经验，特别是产前的胎儿表型及诊断尚无报道。本研究对患有Even-plus综合征的胎儿及父母进行外显子测序分析，明确该家系两次胎儿侧脑室增宽、鼻骨发育不良等表现的致病原因，为遗传咨询、产前诊断及进一步生育方案选择提供依据。

1 资料与方法

1.1 研究资料 选取2021年3月于南京医科大学附属妇产医院就诊的1个Even-plus综合征家系。先证者为2019年8月因“孕12+4周，超声提示双侧侧脑室增宽分别为11.3mm和11.2mm，见少量脑组织漂浮其中、鼻骨显示不清”的引产儿。引产组织行染色体微阵列分析未见异常。先证者母亲于2020年5月，再次因“孕13+1周超声检查提示胎儿颈项透明层增厚3.1mm，胎儿脑积水、胎儿脐膨出可能”引产。胎儿母亲28岁，父亲29岁，表型均正常，非近亲结婚，否认家族遗传病史，共妊娠2次，第一胎儿及第二胎儿均因胎儿侧脑室增宽，脑积水可能、鼻骨发育异常、脐膨出等原因于孕13周左右引产，两次妊娠的超声检查结果见图1。本研究获得了医院伦理委员会批准，家系成员均签署知情同意书。

图1 2019年(图A、B、C)和2020年(图D、E、F、G、H)两次妊娠超声检测结果

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取 收集先证者父母外周血2mL、两次引产胎儿绒毛组织各1g，剪碎后备用。按QIAamp DNA试剂盒(QIAGEN公司，德国)标准操作流程提取皮肤组织中的基因组DNA。采用NanoDrop分光光度计进行DNA浓度及质量检测，选择DNA量大于500ng、DNA浓度大于30ng/μL、A260/280比值在1.8～2.0间的样本进行后续实验。

1.2.2 外显子测序检测 基因组DNA经超声打断后进行建库，采用IDT The xGen Exome Research Panel v1.0全外显子捕获芯片捕获基因组外显子区域后经Nextseq 2000 DNA测序仪完成测序。将测序数据与人类基因组hg19(GRch37)参考序列进行对比。

1.2.3 生物信息学数据分析 测序获得的fastq数据用BWA0.6.2-r126软件与参考基因组(UCSC hg19 Feb.2009)进行比对。SAMtool软件用于去除重复序列，GATK软件进行局部比对和碱基质量校正，得到单核苷酸变异(single nucleotide variants，SNVs)和<50bp的短插入/缺失(short insertions and deletions，indels)。随后运用ANNOVAR软件对SNVs、indels位点进行注释，经人群基因组突变频率数据库(gnomAD)对变异位点进行过滤(最小等位基因频率<0.05)，Revel、PolyPhen-2、SIFT和Mutation Taster等软件进行危害性预测以及HGMD、ClinVar、OMIM、Pubmed等数据库核对基因、表型及报道的相关数据。候选变异位点根据美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG，2015)遗传变异分类标准与指南对突变位点进行致病性分析。

1.2.4 Sanger测序 根据筛选结果，对目标序列进行PCR后，经ABI3730测序仪进行Sanger测序,对家系成员进行变异位点验证，并经序列分析软件得到验证结果。应用NCBI primer blast进行引物设计，针对HSPA9基因c.1822-1G>A位点扩增的正向引物序列为5'-CTTGTACCTTTTTGTATGCCATTTC-3'，反向引物序列为5'-TGCCAGTGAAGTTTATTTTTCTGTG-3'，扩增片段长度280bp；同法扩增HSPA9基因c.1411-3T>G位点的正向引物序列为5'-TCCAAGGAGTTTGTTGTCTCCA-3'，反向引物序列为5'-ACCGTAAATTAGGAGTCTTCCAGT-3'，扩增片段长度208bp。扩增体系:PCR反应体系为25μL，包括12.5μL mix，10μL ddH2O，10μmol/L上、下游引物各1μL，DNA模板1μL。反应条件：95℃ 10min；95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，共35个循环；72℃ 10min。PCR产物送至擎科生物科技有限公司进行双向测序。

2 结 果

2.1 基因变异检测结果 对先证者皮肤组织DNA进行外显子测序检测，20×覆盖度为99.63%，平均测序深度为167。检测出10个可疑致病位点，其中与先证者表型相关的变异为位于5号染色体上HSPA9基因c.1822-1G>A和c.1411-3T>G复合杂合变异。见表1。

表1 先证者及弟弟与HSPA9基因变异相关信息

2.2 Sanger测序结果 先证者及其弟弟HSPA9基因存在c.1822-1G>A和c.1411-3T>G复合杂合变异，分别遗传自父母。见图2。

图2 HSPA9基因突变位点Sanger测序结果

2.3 变异的致病性分析HSPA9基因c.1822-1G>A位点位于经典±1/2的剪接位点，极可能影响15号外显子的剪切导致蛋白编码异常(PVS1_strong);该变异在人群频率数据库如gnomAD、千人基因组等中均未收录，为罕见变异(PM2_supporting)；两例胎儿均携带此变异(PP1)；携带该变异的胎儿症状与基因相符(PP4);依据ACMG指南该变异为可疑致病(PVS1_strong+PM2_supporting+PP1+PP4)。c.1411-3T>G位点在人群频率数据库gnomAD、千人基因组等中均未收录，为罕见变异(PM2_supporting)；反式位置存在致病性变异(PM3)；两例胎儿均携带此变异(PP1)；该位点位于经典剪接位点附近，该变异位点经剪接位点危害性预测软件(mmsplice、dbSNV_ADA、Spidex_z score)预测为可能影响剪接的有害突变(PP3);携带该变异的胎儿症状与基因相符(PP4)。依据ACMG指南该变异为可疑致病变异(PM2_supporting+PM3+PP1+PP3+PP4)。见表2。

表2 Even-plus综合征案例表型与基因变异汇总

3 讨 论

HSPA9基因位于5q31，全长约18kb，有17个外显子和16个内含子，在序列上高度保守。其编码蛋白热休克蛋白A9(heat shock protein,HSPA9)是热休克蛋白70(HSP70)家族成员之一，主要位于线粒体，也可定位于细胞基质、内质网、细胞膜。HSPA9可与新合成的多肽结合，保护大多数器官中的多肽免受应激导致的错误折叠和聚集，并负责促进其稳定性、折叠和降解，以维持细胞蛋白质稳态[9]；作为蛋白质输入马达的核心组成部分，HSPA9是核基因编码的线粒体蛋白转入线粒体这一过程的关键组成部分，其功能异常可导致线粒体蛋白组生物学特征和功能改变[6]。HSPA9与细胞的各项生理活动密切相关，其功能主要与延长细胞寿命、胞内物质运输、线粒体产能、分子伴侣、原癌基因转化、使肿瘤细胞低分化和应激反应等相关。在正常的细胞环境中，它们与特定的伴侣结合，特别是DNAJ伴侣家族，以及特定的核苷酸交换因子(NEF)家族共同发挥作用。此外,其还可识别和结合暴露出疏水残基的错误折叠或变性的蛋白质，提呈泛素化并靶向蛋白酶体对其进行降解[10]。HSPA9在细胞内是一种抗凋亡蛋白，在肿瘤的发生、发展、侵袭、转移中发挥着重要的作用[11-13]。此外，其表达失调、突变和翻译后修饰通常被认为是神经障碍、遗传疾病的主要原因[14]。HSPA9不同位点的基因突变和表达异常可导致帕金森病、骨髓异常增生综合征、急性髓系白血病、贫血、糖尿病心脏病、精子活力下降、乳腺癌、结肠癌、胸腺癌、前列腺癌等情况[2-5,10,15-18]。然而，HSPA9基因在组织胚胎发育过程中的研究甚少。

Even-plus综合征是一种由于HSPA9基因突变导致的骨垢(E)、椎骨(V)、耳(E)、鼻(N)及其他系统症状(plus)的遗传性疾病[1]，具体可表现为神经系统(透明隔发育不全、胼胝体发育不全、发育迟缓、肌张力减退)、面部异常(短头、连眉、弓形眉、外耳发育不全、鼻骨发育不全、三角形鼻孔、单上中切牙)、胸部及胸骨短小、13对肋骨、半椎体、乳头移位、肾积水、单侧隐睾、单侧掌褶、双足内翻、骨骼异常、先天性心脏病等[1]，是极为罕见的常染色体隐性遗传病。根据Orphanet数据库记载，其发病率不足1/1000000。有关HSPA9变异导致人类组织器官发育异常目前仅有5例Even-Plus综合征患者的个案报道[1,7-8]。存活儿可有典型性的颅面部表现、骨骼发育异常，如X线摄片可见骨龄延迟、骨垢骨化不良及髋关节发育不全，脊椎侧位片可诊断椎体冠状位裂等[1]及其他系统的异常表现(表2)。有研究显示[9]，HSPA9参与多种细胞功能，如线粒体蛋白导入、折叠、降解、铁硫簇发生、线粒体稳态和抗凋亡蛋白p53的调节。HSPA9基因的突变，特别是在编码核苷酸结合域内的突变，可引起编码氨基酸结构和功能的改变，如破坏ATP水解，结构域间连接结合、热稳定性和聚集倾向增加等，从而导致一种常染色体隐性遗传性的疾病，即Even-Plus综合征[19]。

在临床上发现的这一家系反复两次在早孕期超声发现胎儿侧脑室增宽、脑部发育异常、鼻骨发育不良、脐膨出等超声异常表现，因胎儿较小，组织器官尚未发育完善，未能发现骨骼、心脏等系统的发育情况，但可见鼻骨发育不全，面中部扁平，且两次妊娠胎儿均存在脑室严重增宽，颅内见少量脑组织漂浮其中，考虑其脑部发育异常，在头面部表型上与已报道的5例已出生的患儿表型相符。虽然心脏发育是否异常不能判断，但先证者弟弟胎儿颈项透明层增厚，亦不排除先天性心脏病的可能性(备注：胎儿颈项透明层增厚有10%的可能是由先天性心脏病引起)。

综上所述，结合该家系的外显子测序结果、表型、遗传方式，考虑先证者及弟弟的HSPA9基因c.1822-1G>A和c.1411-3T>G复合杂合变异，分别遗传自父母，为该家系的致病原因。这两个变异位点目前世界范围内未见报道，且该位点变异导致的胎儿异常超声表现目前未见报道，本发现扩展了HSPA9基因变异的突变谱和表型。该夫妻每生育一胎均有1/4患病几率，在此基础上指导该家系下一步生育方案为三代试管行胚胎植入前诊断排除疾病。

由于本病的发病率低，且常规染色体核型及芯片检查难以发现其基因水平的点突变及其他微小变异，但随着分子遗传学的进展，尤其是外显子测序甚至全基因测序的应用，其报道将会逐渐增多。因此，对于影像学检查发现异常尤其是重复发生的结构异常胎儿，经常规染色体微阵列未能发现与致病变异相关的异常者，建议继续利用分子遗传学的新技术，如家系外显子测序甚至全基因测序检查以辅助发现潜在的基因突变等致病变异，以期帮助寻找致病原因，为今后科学选择再孕方法提供可靠依据和帮助。