胡泽斌 曲守方 黄传峰 黄杰

肌萎缩蛋白基因（dystrophin）位于染色体Xp21.2，包括79 个外显子，其编码的蛋白称为抗肌萎缩蛋白，分布于骨骼肌和心肌的细胞膜上［1］。肌萎缩蛋白基因的变异约70%～80%为一个或多个外显子缺失突变，重复突变约占5%～10%，其余20%～30%为点突变［2］。杜氏进行性肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是由于肌萎缩蛋白基因变异引起的X 连锁隐性遗传性肌肉疾病，患者大多症状严重，伴心肌损害，一般于12 岁前即失去行走能力，多为男性发病，女性大多为DMD 携带者无症状［3］。

国内有多家公司开展不同检测方法的人肌营养不良蛋白基因检测试剂盒的研发，尚未获得国家药品监督管理局的批准上市。中国食品药品检定研究院研制了杜氏肌营养不良基因突变检测国家参考品，包括DMD 基因外显子缺失、重复及点突变等变异类型［4］。本研究使用国家参考品，对人肌营养不良蛋白基因（DMD）检测试剂盒（荧光PCR-毛细管电泳法）的准确性和特异性进行评价。

1 材料与方法

1.1 样本

杜氏肌营养不良基因突变检测国家参考品，由中国食品药品检定研究院（简称中检院）提供。

1.2 试剂

人肌营养不良蛋白基因（DMD）检测试剂盒（荧光PCR-毛细管电泳法）由厦门百欧迅生物科技有限公司提供；GeneScan 500 LIZ Size Standard 和Hi-Di Formamide，购自美国Applied Biosystems 公司。

1.3 仪器

PCR 扩增仪，型号：T100，购自美国BIO RAD公司；基因分析仪，型号：3500Dx，购自美国Life Technologies 公司。

1.4 检测

按照试剂盒说明书进行操作，将国家参考品基因组DNA 分别加入到DMD 引物混合液1 和DMD 引物混合液2 等两个PCR 反应体系中，PCR扩增程序：95℃5 min；（95℃30 S，57℃45 S，72℃90 S），25 个循环；72℃45 min；4 ℃保存。扩增结束后，取1 μL 扩增产物1、1 μL 扩增产物2 和10 μL 1% GeneScan 500 LIZ Size Standard（以10 μL GeneScan 500 LIZ Size Standard 加990 μL Hi-Di Formamide 配制），95℃变性3 min，立即放冰上2 min，在3500Dx 基因分析仪进行检测。反应程序结束后，使用GeneMapper 软件对PCR 扩增产物进行分析。

1.5 结果判读

根据各外显子位点理论扩增片段长度位置，选择单一检测峰。分别计算试剂盒检测范围内的DMD 基因79 个外显子的检测峰与内控峰（HBB和ACTB）的比值（R），根据检测峰比值（R）范围（REX1～REX79）进行外显子基因拷贝数判读，判断样本是否为重复或者缺失突变。

1.6 统计学方法

以所有样本相邻拷贝数的检测结果对应R 值绘制ROC 曲线，以约登指数最大时的R 值确定为区分相邻拷贝数的最佳检测峰判断R 值。

2 结果

2.1 准确性

对试剂盒范围内的性染色正常的DMD 基因缺失或者重复的国家参考品样本，试剂盒均能准确检出标示的相应外显子的缺失或者重复，试剂盒的准确性很好。见表1、图1。

图1 外显子缺失样本CNGB030321-4 的准确性结果Figure 1 The accuracy result of exon deletion mutation sample for CNGB030321-4

表1 试剂盒的准确性结果Table 1 The accuracy result of kit

试剂盒对X0 单体的国家参考品37 号样本的基因拷贝数的检测结果为性别决定基因SRY 无检测峰、1～4 号外显子1 拷贝、5～7 号外显子2 拷贝和8～79 号外显子1 拷贝，按照试剂盒常规基因型判读规则进行判定的结果为1～4 号外显子及8～79 号外显子杂合缺失，与标示的结果（5～7 号外显子重复）并不符合。见图2。

图2 外显子重复样本CNGB030428-37 的准确性结果Figure 2 The accuracy result of exon duplication mutation sample for CNGB030428-37

2.2 特异性

对试剂盒范围外的DMD 基因点突变、微缺失以及未检出致病突变的国家参考品样本，试剂盒均未检出试剂盒范围内1～79 号外显子的缺失或者重复，判定结果为正常型，试剂盒的特异性很好。见表2、图3。

图3 外显子点突变样本CNGB030318-1 的特异性结果Figure 3 The specificity result of exon point mutation sample for CNGB030318-1

表2 试剂盒的特异性结果Table 2 The specificity result of kit

3 讨论

针对DMD 基因变异的分子诊断技术，主要包括Sanger 测序法、多重连接探针扩增（Multiplex ligation dependent probe amplification，MLPA）、微阵列比较基因组杂交技术（array based comparative genomic hybridization，array-CGH）和二代测序技术（Next generation sequencing，NGS）等［5-8］。MLPA技术可以有效检测DMD 基因外显子的缺失和重复突变，但无法在所有外显子区域中发现点突变；荧光PCR-毛细管电泳法可以检测DMD 基因在第1～79 号外显子拷贝数（0、1、2、3）的缺失或重复突变，也不能检测点突变或微缺失引起的DMD 基因异常。杜氏进行性肌营养不良是X 连锁隐形遗传病，患者多为男性，男性患者的双亲一般表型正常，母亲为携带者。目前临床上尚无有效的治疗方法，采用对症的综合治疗，因此遗传咨询及产前诊断至关重要［9-11］。对于DMD 基因治疗，美国食品药品监督管理局于2020年批准日本新药株式会社子公司NS Pharma 公司的药物Viltepso，用于经基因检测证实存在突变、适合使用跳过第53 号外显子（exon 53 skipping）治疗的杜氏肌营养不良症患者［12-13］。DMD 基因变异检测对遗传咨询、产前诊断和DMD 精确治疗具有积极的临床指导意义。

杜氏肌营养不良基因突变检测国家参考品包括17 个外显子缺失、3 个外显子重复及10 个点突变的DMD 变异类型样本，使用NGS 和MLPA 方法验证。基于荧光PCR-毛细管电泳法的检测DMD 外显子缺失或重复的试剂盒，DMD 基因拷贝数的判读基于以下规则：正常女性性染色体为XX，两条X 染色体上正常的DMD 基因1～79 号外显子分别为1 拷贝，女性正常型为2 拷贝，当其中一条X 染色体上的DMD 部分外显子缺失或重复，其相应外显子的拷贝数即为1（杂合缺失）或3（杂合重复）；正常人类男性性染色体为XY，一条X 染色体上正常的DMD 基因1～79 号外显子均为1 拷贝，DMD 部分外显子的缺失或重复均导致其编码的抗肌萎缩蛋白异常而发病，其相应外显子的拷贝数即为0（半合缺失）和2（半合重复）。研究结果显示试剂盒对国家参考品37 号样本的基因拷贝数检测结果为1～4 号外显子及8～79 号外显子杂合缺失，与标示为5～7 号外显子重复的结果并不符合。查阅国家参考品的研究资料显示37 号样本为XX/X0 嵌合，并且XO 细胞所占比例偏高，XX部分为外显子5～7 号杂合重复，X0 部分为外显子5～7 号半合重复［4］。但当X 性染色体数目异常时，如女性X0、XXX 和男性XXY 的X 染色体数目与正常人不同，因此其DMD 基因拷贝数的正常和异常判断并不适用性染色体正常的规则。胚胎组织在发育过程中发生基因突变，可导致嵌合体发生，即一个个体具有2 个或2 个以上的细胞系。研究报道DMD 生殖细胞嵌合体遗传家系，父母为生殖腺嵌合体，自身不发病，但可导致子代发生DMD 基因新发突变［14-15］。另有研究报道DMD 体细胞嵌合体遗传家系，需考虑父源/母源均存在嵌合体突变的可能［16］。国家参考品37 号样本是体细胞嵌合的样本，试剂盒只检测到XO细胞的外显子5～7 号重复，结果表明试剂盒不适用检测DMD 嵌合体样本。因此试剂盒对样本的DMD 基因拷贝数的分析应结合其性染色体进行综合判断，同时对嵌合样本给出相应的补充说明，才能避免检测错误。

本研究结果显示试剂盒对国家参考品中性染色体正常的DMD 基因缺失或者重复的样本，均能准确检出标示的相应外显子的缺失或者重复；对国家参考品中DMD 基因点突变、微缺失以及未检出致病突变的样本，均未检出试剂盒范围内的1～79 号外显子的缺失或者重复，具有很好的准确性和特异性。国家参考品可以用于评价荧光PCR-毛细管电泳法的人肌营养不良蛋白基因检测试剂盒的准确性和特异性，拓宽了检测方法的适用性。