万航娟，罗 丽，何 蔚

（1.赣南医学院2019级硕士研究生；2.赣南医学院药理学教研室；3.江西省脑血管药理重点实验室；4.心脑血管疾病防治教育部重点实验室，江西 赣州 341000）

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种常见的中枢神经退行性疾病，其发病机制复杂。研究发现，β-淀粉样蛋白（amyloid β，Aβ）在脑组织聚集形成淀粉样斑块及Aβ诱导内质网（endoplasmic reticulum，ER）持久应激反应导致神经损伤可能是AD的重要发病机制之一。ER应激相关分子葡萄糖调节蛋白78（Glucose-regulated protein 78，GRP78），也称为免疫球蛋白重链结合蛋白（immunoglobulin heavy chain binding protein，BiP）或 HSPA5，是热休克蛋白70（Heat Shock Protein 70，HSP70）家族的成员，存在于所有真核生物的ER膜上，是ER的分子伴侣。GRP78具有防止错误折叠的蛋白质或蛋白质亚基转运的作用。当蛋白折叠错误时，机体发生未折叠蛋白反应（The unfolded protein response，UPR），UPR是ER应激触发的一种机体适应性保护机制，旨在修复正常的ER功能。但是，持久或过度的ER应激可使UPR过度激活，UPR成为不良适应并可能促进细胞凋亡。蛋白激酶RNA样ER激酶（protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum ki‐nase，PERK）是UPR反应的效应蛋白，当机体触发UPR，GRP78从PERK解离，PERK自身二聚化和C端Thr980位点自我磷酸化，激活的PERK可增强真核翻译起始因子2α（eukaryotic translation initiation factor-2α，eIF2α）蛋白Ser51位点磷酸化激活，磷酸化的eIF2α增加ATF4的翻译并诱导C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）的表达，CHOP在细胞的氧化应激反应中起重要作用，主要有抑制细胞生长、促进DNA损伤等作用。Aβ大量聚集可导致ER持久应激反应，进而促使PERK和eIF2α磷酸化激活，引起CHOP表达上调，诱发神经损伤，导致AD发生和发展[1-2]。

沉默信息调节因子1（Silent information regula‐tor 1，SIRT1）是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖性组蛋白去乙酰化酶，在应激反应和细胞存活等生物学过程中起着重要作用。近期研究证实，SIRT1可通过抑制细胞凋亡和自噬等多种机制防止ER应激诱导的细胞损伤[3]。SIRT1激活对包括AD在内的神经退行性疾病的神经损伤具有保护作用，SIRT1可作为治疗AD的潜在药物靶点[4]。

欧前胡素（Imperatorin，IMP）是伞形科植物蛇床子、白芷、羌活等的有效成分之一，是一种呋喃香豆素。研究显示，欧前胡素具有抗炎、抗氧化和神经保护等作用[5-8]，但其药理作用及作用机制尚未完全阐明。我们前期研究发现，欧前胡素在跳台实验和八臂迷宫行为学实验中对AD模型小鼠的学习记忆障碍具有明显的改善作用，另外，欧前胡素可减轻Aβ1-42致AD模型小鼠的神经性炎症和氧化应激损伤[9-11]。但是，欧前胡素防治AD的作用机制还未完全阐明。本研究将观察欧前胡素对SIRT1表达及对磷酸化PERK/eIF2α蛋白表达的影响，进一步探讨欧前胡素防治AD的作用机制，为欧前胡素临床上用于防治AD提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级BABL/c小鼠，雄性，体重20～25 g，湖南斯莱克景达有限公司提供，生产许可证SCXK（湘）2019-0004。实验过程严格遵守实验动物使用相关伦理规定。

1.2 药品与试剂欧前胡素购自中国食品检定研究所（批号110826-201918，纯度99.5%），Aβ1-42购自sigma公司（货号 A9810-0.1MG），pierceTMBCA Protein Assay Kit购自Thermo公司（货号23227），LDH和MTT试剂盒购自南京建成有限公司，GRP78 ELISA检测试剂盒购自江苏晶美生物科技有限公司，SIRT1 ELISA检测试剂盒购自江苏晶美生物科技有限公司，β-actin（货号 4979）、eIF2α（货号9722）、p-eIF2α（货号 9721）、GRP78（货号 3177）、p-PERK（货号3179）、SIRT1（货号2493）、山羊抗兔IgG（货号7074）均购自Cell Signaling Technology公司，CHOP购自博士德生物工程有限公司，SuperSignalTMWest Pico Plus Luminol/Enhancer购自美国Thermo公司，二甲亚砜购自美国sigma公司（货号D2650）。

1.3 实验仪器Bio-Rad电泳系统（Bio-rad公司），Thermo Variokan Flash全波长读数仪（Thermo Fisher公司），TS-1000型脱色摇床（江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司），多用途旋转摇床（江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司），隔水式电热恒温培育箱（上海新苗医疗器械制造有限公司），高速冷冻离心机（Thermo Fisher有限公司），恒温浴槽HSS-1B（成都仪器厂），G box化学发光成像系统（美国Syngene公司），振动切片机（英国Campden Instruments公司），分析天平（瑞士Mettler toledo公司）。

1.4 离体脑片损伤模型制备与分组SPF级BABL/c雄性小鼠，体重20～23 g，8周龄，购自湖南斯莱克景达实验有限公司，自由饮食和自然条件下饲养1周，小鼠腹腔注射10%水合氯醛（350 mg·kg-1），小鼠麻醉后快速断头取脑，置于预冷的氧饱和人工脑脊液中冷却3 min后取出，使用振动切片机进行冠状切片制备离体脑片，切片厚度为400 μm。提前在24孔板中加入适量人工脑脊液，切好的脑片迅速转移到24孔板中，将24孔板转移至培养箱中（37 ℃、95% O2和5% O2）复苏30 min，进行离体脑片实验。脑片随机分为五组，分别为正常对照组（control）、溶媒对照组（vehicle）、Aβ1-42组（Aβ1-42）、Aβ1-42+欧前胡素低剂量组（IMP-L）、Aβ1-42+欧前胡素高剂量组（IMP-H）。在脑片复苏后，分别在溶媒对照组、欧前胡素低剂量组和欧前胡素高剂量组加入1%DMSO、10 μM和30 μM欧前胡素，孵育15 min后，分别在Aβ1-42组、欧前胡素低剂量组和欧前胡素高剂量组中加入10 μM Aβ1-42孵育12 h。

1.5 LDH活性检测和MTT实验脑片孵育结束后收集脑片，按照试剂盒说明书操作，用LDH活性检测脑片损伤和MTT法检测脑片活力。

1.6 ELISA检测脑片组织中SIRT1和GRP78的含量按照试剂盒说明书处理脑片组织样本，制备样品，按照说明书的步骤严格操作，蛋白定量使用BCA蛋白定量法检测。

1.7 小鼠AD模型的建立将灭菌用水加入Aβ1-42试剂瓶中，于37℃温育箱孵育4 d。用10%水合氯醛（350 mg·kg-1）给小鼠腹腔注射，小鼠麻醉后进行侧脑室内注射，根据侧脑室注射位点立体定位（AP：−0.5 mm，ML：±1.0 mm，DV：−2.5 mm），用10 μL微量注射器缓慢注射410 pmol（3 μL）Aβ1-42，注射结束后停针3 min再拔针。对照组小鼠注射相同体积的灭菌注射用水。

1.8 实验动物分组与给药雄性小鼠随机分成正常对照组、AD模型组、AD模型+欧前胡素2.5 mg·kg-1组（IMP-L）、AD模型+欧前胡素5.0 mg·kg-1组（IMP-H）。欧前胡素给药组自造模当天开始腹腔注射给药，给药体积为10 mL·kg-1，1次·d-1，连续13 d，正常对照组和AD模型组小鼠在相同时间腹腔注射等量溶媒进行对照。

1.9 小鼠海马组织中蛋白的测定小鼠腹腔注射给药连续13 d后，将动物麻醉断头取脑，分离出海马组织并分装于冷冻管中，液氮中保存，用于各观察指标测定。按照试剂盒说明书处理海马组织样本，制备样品，按照说明书的步骤严格操作，蛋白定量使用BCA蛋白定量法检测。

1.10 Western Blot检测蛋白的表达给药13 d取小鼠的海马组织，提取细胞总蛋白后，用BCA定量法将蛋白定量至100 μg，制备8%聚丙烯酰胺凝胶，每孔上样20 μL，经过SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，恒压转膜，将蛋白转至PVDF膜后，用5%脱脂奶粉室温封闭 1 h，封闭后加一抗 SIRT1（1∶1 000），PERK（1∶1 000）、p-PERK（1∶500）、eIF2α（1∶1 000）、p-eIF2α（1∶500）、GRP78（1∶500）和 CHOP（1∶500）4℃冰箱孵育过夜，TBST洗膜后，PVDF膜中加入二抗（1∶5 000），室温孵育1 h。膜经过TBST洗涤后，在暗室中加入显影液，化学发光法检测，扫描灰度值用Image J软件对条带进行灰度分析。

1.11 统计方法数据使用SPSS软件进行分析，用GraphPad Prism软件绘图，数据以均数±标准差表示，多组间比较使用单因素方差分析，两组间比较使用LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 欧前胡素对Aβ1-42致小鼠离体脑片损伤后LDH活性的影响与溶媒对照组相比，Aβ1-42损伤组小鼠脑片组织中LDH的活性明显升高（P＜0.01）；与Aβ1-42损伤组比较，用10 μM和30 μM欧前胡素预处理后脑片组织中LDH活性明显降低（10 μM组：P＜0.05，30 μM组：P＜0.01），差异有统计学意义（图1）。

图1 欧前胡素对Aβ1-42致小鼠离体脑片损伤后LDH活性的影响（n=6，±s）

2.2 欧前胡素对Aβ1-42致小鼠离体脑片损伤后脑片活力的影响与溶媒对照组相比，Aβ1-42损伤组小鼠脑片损伤后脑片活力降低（P＜0.05），与Aβ1-42损伤组比较，10 μM欧前胡素预处理组脑片活力有升高的趋势，但无统计学意义，30 μM欧前胡素预处理组脑片活力升高（P＜0.01），差异有统计学意义（图2）。

图2 欧前胡素对Aβ1-42致小鼠离体脑片损伤后脑片活性的影响（n=4，±s）

2.3 欧前胡素对Aβ1-42致小鼠离体脑片损伤后SIRT1和GRP78含量的影响ELISA结果显示，与溶媒对照组相比，Aβ1-42损伤组小鼠脑片SIRT1水平降低（P＜0.01）（图3），GRP78水平升高（P＜0.05）（图4）；与Aβ1-42损伤组比较，10 μM欧前胡素预处理组脑片组织中SIRT1水平有升高的趋势，但无统计学意义，30 μM欧前胡素预处理组脑片组织中SIRT1水平升高（P＜0.05），差异有统计学意义（图3），10 μM和30 μM欧前胡素预处理组脑片组织中GRP78水平降低（10 μM组P＜0.05，10 μM组P＜0.01），差异有统计学意义（图4）。

图3 欧前胡素对Aβ1-42致小鼠离体脑片损伤后SIRT1含量的影响（n=6，±s）

图4 欧前胡素对Aβ1-42致小鼠离体脑片损伤后GRP78含量的影响（n=6，±s）

2.4 欧前胡素对小鼠海马组织中SIRT1蛋白表达的影响与假手术组比较，AD模型组小鼠的海马组织中SIRT1的蛋白表达比假手术组低（P＜0.05）；与AD模型组比较，欧前胡素低剂量给药组中SIRT1的蛋白表达有上升的趋势，但差异无统计学意义，欧前胡素高剂量给药组中SIRT1的蛋白表达水平比AD模型组高（P＜0.05），差异有统计学意义（图5）。

图5 欧前胡素对AD小鼠海马组织中SIRT1蛋白表达的影响（n=4，±s）

2.5 欧前胡素对小鼠海马组织中GRP78蛋白表达的影响与假手术组比较，AD模型组小鼠的海马组织中GRP78的蛋白表达比假手术组高（P＜0.05）；与AD模型组比较，欧前胡素用药组中GRP78的蛋白表达比AD模型组低（2.5 mg·kg-1组：P＜0.05，5.0 mg·kg-1组：P＜0.01）（图6），提示欧前胡素可抑制GRP78的蛋白表达，对内质网应激反应有一定的抑制作用。

图6 欧前胡素对AD小鼠海马组织中GRP78蛋白表达的影响（n=4，±s）

2.6 欧前胡素对PERK、p-PERK、eIF2α和p-eIF2α蛋白表达的影响与假手术组相比，AD模型组小鼠的海马组织中p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α的比值均比假手术组高（对于p-PERK/PERK，P＜0.05；对于p-eIF2α/eIF2α，P＜0.01）。与AD模型组比较，2.5 mg·kg-1欧前胡素用药组中p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α的比值变化均不明显，差异均无统计学意义；5.0 mg·kg-1欧前胡素用药组中p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α的比值均比AD模型组低（P均＜0.01）（图7，图8）。提示欧前胡素可抑制AD小鼠的海马组织中PERK和eIF2α的磷酸化激活。

图7 欧前胡素对AD小鼠海马组织中p-PERK/PERK的影响（n=4，±s）

图8 欧前胡素对AD小鼠海马组织中p-eIF2α/eIF2α的影响（n=4，±s）

2.7 欧前胡素对CHOP蛋白表达的影响与假手术组比较，AD模型组小鼠的海马组织中CHOP的蛋白表达比假手术组高（P＜0.01）；与AD模型组比较，2.5 mg·kg-1欧前胡素给药组CHOP的蛋白表达变化不明显，差异无统计学意义，5.0 mg·kg-1欧前胡素给药组CHOP的蛋白表达水平比AD模型组低（P＜0.01），差异有统计学意义（图9）。

图9 欧前胡素对AD小鼠海马组织中CHOP的影响（n=4，-x±s）

3 讨论

侧脑室内注射Aβ1-42诱导AD模型是一种常用的“Aβ级联反应假说”相关AD动物模型，被国内外学者用于研究AD的发病机制以及用于筛选和评价药物的抗AD作用。我们前期采用跳台法观察到欧前胡素能改善Aβ1-42致小鼠AD后学习记忆障碍，用八臂迷宫实验观察了欧前胡素对AD模型小鼠的空间学习记忆障碍的影响，提示欧前胡素对AD的学习记忆障碍具有保护作用。同时，本课题组还证实欧前胡素可减轻AD模型小鼠氧化应激反应和神经性炎症反应[9-11]。本实验我们参照本课题组前期实验，选用2.5 mg·kg-1和5.0 mg·kg-1腹腔注射给药，连续给药 13 d[9-11]，进一步观察了欧前胡素对 Aβ1-42致AD模型小鼠ER应激反应及相关蛋白的影响。

ER应激反应是一种适应性保护机制，可防止应激后ER稳态的破坏。研究证实，ER应激与AD的病理机制密切相关，轻微ER应激反应在AD发病中具有保护作用，过强的ER应激反应可导致细胞死亡，从而促进AD的发生发展[12-13]。GRP78是一种重要的ER分子伴侣，参与调控ER应激反应，GRP78是ER应激的重要标志蛋白。Aβ聚集可诱导ER应激反应及上调GRP78的表达[14]。本研究显示，欧前胡素可抑制Aβ1-42致离体脑片损伤，减少LDH释放，增加脑片活力，减少GRP78的产生。另外，给小鼠脑室内注射Aβ1-42后海马组织中GRP78的蛋白水平上调，欧前胡素用药组小鼠海马组织中GRP78蛋白水平较低，提示欧前胡素可抑制Aβ1-42诱导AD模型小鼠GRP78水平的上调，对Aβ1-42诱导小鼠海马组织ER应激反应有一定程度的抑制作用。

研究显示，在AD患者和AD实验动物模型的大脑中PERK和eIF2α磷酸化激活水平均明显上升，PERK和eIF2α信号通路激活是AD的重要发病机制之一[15]。PERK的基因缺失可抑制eIF2α Ser51位点的磷酸化激活，减轻神经损伤，改善APP/PS1 AD小鼠的空间记忆障碍。研究还发现，另一种eIF2α激酶GCN2的缺失也可抑制eIF2α的磷酸化激活，抑制神经损伤，从而改善APP/PS1小鼠空间记忆障碍[16]。本研究显示，AD模型小鼠海马组织中p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α的比值均增加，欧前胡素用药组海马组织中p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α的比值均比AD模型组低，提示欧前胡素可抑制PERK/eIF2α的磷酸化激活，缓解Aβ1-42诱导ER应激导致的神经损伤，从而发挥对AD的神经保护作用。

PERK/eIF2α磷酸化激活可增加ATF4的表达，进而诱导下游CHOP表达上调。CHOP具有抑制细胞生长和促进DNA损伤的作用。CHOP过表达可通过线粒体途径诱导细胞凋亡，敲除CHOP基因或下调CHOP的表达可减轻内质网应激反应诱导的细胞凋亡[17]。本研究显示，AD模型小鼠海马组织中CHOP的蛋白表达明显升高，欧前胡素可下调海马组织中CHOP的蛋白表达，提示欧前胡素可能通过抑制CHOP的蛋白表达，缓解Aβ1-42诱导ER应激导致的神经损伤。

SIRT1可通过增强细胞的抗应激能力促进细胞生存，对ER应激诱导的细胞损伤具有保护作用[18]。研究证实，SIRT1通过去乙酰化作用在赖氨酸位点使eIF2α脱乙酰基，从而抑制PERK/eIF2α通路的过度活化[19]。ZHANG Y等[20]发现SIRT1通过降低Aβ的前体蛋白APP、提高BACE-1活性，对神经细胞有保护作用。SIRT1天然激活剂可上调SIRT1的表达，减轻AD模型小鼠中枢神经系统退行性变化和改善认知功能障碍。SIRT1的过表达可抑制Aβ1-42诱导的小胶质细胞BV2细胞NF-κB途径激活，并减轻Aβ对原代培养大脑皮层细胞的毒性[21]，促进SIRT1的表达，对AD模型实验动物具有神经保护作用[22]。本研究显示，AD模型小鼠海马组织中SIRT1的蛋白表达量明显下降，欧前胡素可上调SIRT1的蛋白表达含量，提示欧前胡素可能通过上调SIRT1，减轻ER应激诱导的神经损伤。

总之，欧前胡素可上调Aβ致AD模型小鼠海马组织中SIRT1表达，抑制PERK/eIF2α的磷酸化激活，降低CHOP表达，减轻Aβ诱导ER应激反应所致的神经损伤，这可能是欧前胡素防治AD的作用机制之一。本课题组将进一步研究欧前胡素抗AD的机制，为欧前胡素临床用于治疗AD提供理论依据。