c-Myc是一种转录因子，在细胞的生长、增殖和凋亡发挥重要重要作用。研究表明c-Myc作为转录中心的作用，其可转录调节某些miRNA 的表达，而这些miRNA为调节性小RNA家族，通过靶向蛋白质编码基因发挥作用。泛素（Ub）是含有76 个氨基酸残基的蛋白质，可以通过E1-E2-E3 级联反应传递至底物蛋白介导蛋白质的泛素化。在真核细胞中，泛素化是一种重要的蛋白质翻译后修饰，它可以通过26 S 蛋白酶体介导底物蛋白的降解，或者调节底物蛋白的生物学功能。有研究表明冬凌草甲素可通过促发FBW7介导的c-Myc蛋白酶体降解过程抑制白血病细胞的增殖及转移。

有研究表面，胡桃醌具有体外抗肿瘤的作用，例如胃癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌等。本课题组前期研究表明胡桃醌可抑制宫颈癌细胞得增殖并促进其凋亡，而其机制尤其是对c-Myc蛋白的影响尚不清楚，故本研究拟在针对性研究胡桃醌对转录因子c-Myc蛋白泛素化降解的影响旨在为胡桃醌作为靶向药物，为宫颈癌的治疗提供分子生物学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

HeLa细胞系来自中科院上海细胞生物学研究所，保存于吉林医药学院实验室，培养液用Penicillin-Streptomycin Solution、胎牛血清与 Dulbecco's Modified Eagle Medium 培养基均来自杭州四季青公司，并按1∶10∶100配制。周期与凋亡试剂盒（碧云天）；胡桃醌和溴化四氮唑蓝（MTT，Sigma）。各类单克隆抗体以及二抗（Santa Cruz）。MOTIC AE31显微镜（北京汗盟紫星仪器仪表有限公司）；伯乐-550型全自动酶标仪（上海领成生物科技有限公司）。

1.1 RNA干扰试验

c-Myc敲低细胞株购自长春润一生物有限公司。构建的3条c-Myc干扰序列：1：5'-GAGGGTCAAGTT GGACAGTGT-3'；2：5'-AAACACAAACTTGAACAG CTA-3'；3：5'-CTGCGACGAGGAGGAGAACTT-3'。含有si c-Myc基因通过Lip 2000试剂盒（Invitrogen）加入到无青链霉素的培养液中。培养6 h后，换成完全培养基再培养48 h，Western bolt检测细胞中c-Myc的表达情况。

(1)大学生网络借贷的影响因素分析。将大学生的性别、年级、专业类型、每月生活费和家庭年收入作为相关因素，对大学生是否使用过网络借贷平台进行logistics回归分析。得到结果如表1：

1.2 MTT法检测各组细胞增殖

将对数生长期的HeLa 细胞分成4 组：空载体组（si-NC）；胡桃醌组（空载体加20 μmol/L 胡桃醌处理）；si-cMyc 组（转染Myc RNA）；si-cMyc20 μmol/L胡桃醌组（转染Myc RNA加20 μmol/L胡桃醌处理）。24 h后的4组细胞转移至离心管在1000离心4 min，离心后用细胞计数板计算细胞数量，在培养皿中加入细胞悬液及一定量培养液，以5×10/孔接种于96孔细胞培养板，放入细胞培养箱中培养24 h。将配制好胡桃醌以20 μmol/L的浓度干预24 h 后，5 g/L 的MTT 以每孔20 μL 孵育4 h，DMSO 溶解蓝紫色结晶在490 nm 测定吸光度（）值。

1.3 流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡率

细胞处理及分组情况同1.2，细胞用消化后离心，用1 mL冰浴的PBS缓冲液重悬离心后加入70%乙醇固定30 min。固定好的细胞用PBS缓冲液再次离心去上清，将事先配制好保存于4 ℃条件下的的碘化丙啶（PI）染色液以每管0.5 mL加入细胞样品染色30 min，此过程需要温浴，并避光，染色完成后进行检测。

1.4 免疫共沉淀实验（Co-IP）

与对照组相比，不同浓度的胡桃醌可降低c-Myc蛋白水平，而图1B示20 μmol/L胡桃醌处理12 h后c-Myc蛋白水平下调，在12 h更加显著（＜0.01，图1A）。

研究在不同射击工况下的弹丸膛内运动规律，对弹丸装药的设计和弹炮匹配性设计具有一定的指导意义，未来将对不同磨损程度的身管内弹丸运动规律作进一步的研究。

1.5 泛素化实验

胡桃醌可下调c-Myc 的表达，但加入0.5、1.0、2.0 μmol/L的MG132后即可逆转胡桃醌对的c-Myc下调作用，而1.0 μmol/L更加显著（＜0.05，＜0.01），稳定了c-Myc蛋白的表达（图3）。

1.6 Western blotting法检测细胞凋亡相关蛋白表达量

与对照组相比，HA-Ub转染组存在c-Myc泛素化修饰，而以胡桃醌处理后可明显增强c-Myc的泛素化水平（图4）。

正向引导，克服对手机的过度依赖，树立抵制上课使用手机的自觉意识 大学生是一个容易接受新鲜事物的群体，处于“三观”形成的关键时期。可以通过主题团日活动、专题演讲、专题教育活动等形式，正向引导学生，克服对手机的过度依赖，意识到随时随地使用手机是一个“问题习惯”，让学生认识到上课使用手机弊大于利，是对教师不尊重、对家长和自己不负责的行为，让学生牢固树立抵制上课使用手机的自觉意识[8]，养成良好的手机使用习惯来减少上课不合理使用手机的行为。

1.7 CHX脉冲追踪测定目的蛋白表达

Western blot 检测转入干扰RNA 后蛋白表达，3种干扰RNA 均降低，以第3 种更为显著（图5A、B），故选折第3 种干扰RNA 做后续实验。MTT结果显示，与未敲除组（：0.89±0.15）相比，20 μmol/L胡桃醌可明显降低细胞增殖（：0.34±0.08，＜0.01），而敲除c-MyC基因后明显消减了胡桃醌对HeLa细胞增殖的抑制（：0.57±0.05，＜0.05，图5C）。图5D、E流式细胞仪检测结果表明与未敲除组（早期凋亡率：2.56±0.24）相比，20 μmol/L胡桃醌可明显升高细胞早期凋亡率（早期凋亡率：18.45±3.53，＜0.01），而敲除c-MyC基因后明显消减了胡桃醌对HeLa细胞促凋亡活性，（早期凋亡率：11.34±5.34，＜0.05）.

爪极永磁式交流测速电机的永磁转子轴向充磁，磁极的极性用N和S表示；导磁爪有6个：上爪极(白色)A、C、E和下爪极(黑色)B、D、F。永磁转子N极、导磁爪A、导磁爪D、永磁转子S极构成磁回路，如图2(a)所示，磁场方向垂直于纸面；生成的感应电动势按照正弦规律变化，如图2(b)所示。

1.8 统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，正态分布的数据以均数±标准差表示，多组间样本均数比较采用单因数方差分析，组间两两比较采用SNK-检验。以＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胡桃醌对HeLa细胞c-Myc蛋白表达的影响

生长状态较好的HeLa细胞以6×10/孔的密度接种于6孔板中，转染相应载体与目的质粒，转染24 h后加入MG132 孵育4h。弃去培养基，后用PBS 清洗1次，加入1 mL RIPA 缓冲液，移液枪吹打细胞混匀，转移至离心管中，冰上裂解30 min，每隔10 min震荡1次。4℃离心10 min，上清转移至新的离心管中，每个样品取50 μL 上清混合10 μL6×上样缓冲液，99 ℃加热10 min作为样品，在剩余上清中每管加入加入20 μL 预处理的蛋白质A/G 琼脂糖，4 ℃垂直旋转孵育过夜。5000 r/min，4 ℃离心2 min，弃上清，加入1 mL PBS清洗3次，收集磁珠。向余下的磁珠中加入50 μL上样缓冲液，99 ℃加热10 min，先瞬离后震荡离心，得到的样品进行Western blot实验。

2.2 胡桃醌对c-Myc蛋白泛素化降解的影响

与对照组相比，在CHX存在情况下，胡桃醌可明显缩短c-Myc的半衰期；CHX作用8 h后胡桃醌诱导的c-Myc发生明显下降（＜0.01，图2A、B）。

2.3 蛋白酶体抑制显著抑制胡桃醌对c-Myc蛋白的下调影响

将HeLa 细胞铺入六孔板中，使细胞16～18 h后密度达到50%～60%。用Lip2000 转染的方法将2.5 μg Flag-Ub，24 h后再以20 μmol/L处理24 h，后加1.0 μmol/L MG132抑制蛋白降解，再过4 h后收样。收样之后用RIPA裂解液冰上裂解细胞30 min，用HA抗体去检测c-Myc的泛素化条带。

2.4 胡桃醌通过泛素化蛋白酶体途径促进c-Myc蛋白降解

收集培养的细胞并用冷PBS 缓冲液洗涤后加入裂解缓冲液裂解细胞，整个裂解过程需要10 min，在1.2×10g 离心10 min，检测上清浓度，取50 μg 蛋白进行SDS-PAGE电泳，之后转膜。室温下，PVDF在5%非脂肪牛乳中封闭膜2 h，加入Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3和PARP（1∶5000），β-actin（1∶1000）一抗，在4 ℃环境下过夜。第2天用TBST洗涤，以1∶10 000稀释度将膜与二抗在室温避光条件下孵育2 h，加底物发光并拍照。

2.5 敲除c-Myc后用胡桃醌处理对HeLa细胞增殖及凋亡的影响

将处于生长状态较好的HeLa细胞接种于24孔板，接种密度使第2天生长到70%～80%左右，后以10、20、50 μmol/L处理12 h。将1 g CHX溶解于10 mL DMSO，将其配制成100 mg/mL母液，于细胞中加入100 mg/mL母液使其终浓度为10～20 μg/mL，继续培养，分别于0、2、4、8、12 h 分别裂解细胞使用Western blot法检测c-MyC蛋白降解情况。

3 讨论

本研究中，我们分析并确定了转录调节因子c-Myc是胡桃醌的分子靶标。研究表明，c-Myc在细胞增殖过程中具有双重作用，因为它即可以促进细胞生长也可诱导细胞凋亡。我们的结果显示抑制c-Myc表达的抑制可导致细胞增殖减慢并促进其凋亡（图5B、C），这表明c-Myc是与宫颈癌致癌相关。由于其致癌特性，c-Myc已被证明作为癌症治疗的有效靶标。故目前正在进行包括使用反义寡核苷酸、siRNA、小分子和天然化合物等旨在靶向c-Myc治疗癌症的策略，在这些方法中，天然化合物由于其强大的抗癌活性和相对安全性，近年来受到了特别的关注。例如，作为天然化合物的冬凌夏草及姜黄素靶向c-Myc 并表现出抗癌活性。然而，研究天然化合物靶向c-Myc的机制仍需进一步探讨。本研究表明不同胡桃醌处理HeLa细胞后可降低c-Myc蛋白质水平，而敲除c-myc后可消减其对HeLa增殖抑制作用。

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由于蛋白质是细胞功能的执行者，所以促进c-Myc蛋白的降解可能比下调c-Myc表达的策略更有效。蛋白质的降解有溶酶体和蛋白酶体两种途径，泛素-蛋白酶体途径是维持细胞中蛋白稳态的重要途径之一。泛素分子通过E1泛素活化酶、E2结合酶、E3连接酶与靶蛋白结合，经由泛素-蛋白酶体通路吞噬、降解靶蛋白。我们用不同浓度的蛋白酶体抑制剂MG132与胡桃醌联合使用结果显示，抑制剂可逆转胡桃醌对c-Myc蛋白下调作用，说明泛素蛋白酶体依赖性途径参与了胡桃醌诱导的c-Myc蛋白下调过程。

统计对比发现，雷米普利组干咳者6例，占有率为：16.22%，头晕者4例，占有率为10.81%，总的不良反应发生率为：27.03%，替米沙坦组轻微咳嗽者1例，占有率为2.70%，头晕者1例，占有率为2.70%，总的不良反应发生率为：5.40%，替米沙坦组的不良反应发生率显著低于雷米普利组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

研究表明泛素-蛋白酶体系统在调节不同细胞发生过程中关键蛋白质的丰度方面发挥着至关重要的作用。在许多类型的癌症中都观察到了泛素-蛋白酶体系统的失调，并且正在开展针对泛素-蛋白酶体系统进行癌症治疗的研究。而本次针对对c-Myc蛋白泛素化水平检测中发现，胡桃醌可增强其泛素化降解水平。

然而蛋白酶体降解有2 个限速步骤：其一为底物蛋白的特异性修饰，例如磷酸化，以及泛素与底物蛋白的酶促连接。在这项研究中，我们只证明胡桃醌可通过蛋白酶体途径促进c-Myc的降解，但其机制需进一步探讨。