姜雪，李梦萦，林芳旭，石琼瑶，刘宇，郭艺红

(郑州大学第一附属医院生殖医学中心 河南省生殖与遗传重点实验室，郑州 450052)

卵巢储备功能是指卵泡生长、发育并形成可受精的卵母细胞的能力，包括卵巢内卵母细胞的质量和数量，常被用来评估女性生育能力[1]。影响卵巢储备功能的因素包括年龄、体质量指数(BMI)[2]、遗传因素、免疫因素、医源性因素、环境污染以及心理因素等。当各种因素导致卵巢内卵母细胞数量减少和(或)质量下降，生育能力下降甚至不孕，称为卵巢储备功能下降(decreased ovarian reserve，DOR)。DOR发病率逐年上升，而且在接受辅助生殖技术(ART)助孕治疗中具有卵巢低反应、获卵数少、卵母细胞质量差等特点常导致助孕结局不理想[3-4]。

目前，对DOR定义尚未形成共识，临床上多以年龄、抗苗勒管激素(AMH)、月经周期第2～3天基础FSH(bFSH)和基础窦卵泡计数(AFC)联合评估卵巢储备功能[5]。作为评估卵巢储备功能的重要指标，AMH、FSH、AFC也常被用来研究与ART生殖结局的相关性[6-7]，也包括宫腔内人工授精(IUI)[8]。年龄是影响卵巢储备功能的重要因素，一般认为35岁是卵泡数量消耗的拐点，>35岁女性的卵母细胞数量减少速度加快，卵巢储备功能急剧下降[9]。鉴于DOR可发生于任何年龄段的育龄期女性，本研究拟在不同年龄段中探讨卵巢储备功能对夫精宫腔内人工授精(AIH)妊娠结局的影响。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2016年1月至2019年6月于我院生殖医学中心行AIH助孕7 431个周期患者的临床资料，数据来源于郑州大学第一附属医院生殖医学中心临床生殖医学管理系统/电子病历数据库(CCRM/EMRCD)。

纳入标准：(1)子宫输卵管造影或宫腔镜检查显示患者双侧输卵管通畅；(2)男方精液满足《人类辅助生殖技术规范》[10]中制定的AIH适应证。排除标准：(1)染色体异常；(2)子宫内膜异位症、宫腔粘连、生殖系统解剖异常患者；(3)高泌乳素血症、甲状腺功能减退或亢进、垂体或甲状腺肿瘤等内分泌疾病；(4)复发性流产等不良孕产史；(5)失访或核心数据(如年龄、AHM等)缺失。

共纳入7 431个周期。根据血清bFSH和AMH水平分为两组：FSH≤10 U/L和(或)AMH≥1.0 ng/ml患者为卵巢储备功能正常(NOR)组(n=6 532)，FSH>10 U/L和(或)AMH<1.0 ng/ml患者[11]为DOR组(n=899)。

二、研究方法

1.治疗方案：根据患者月经周期是否规律以及排卵功能决定治疗方案。月经规律且能正常排卵的患者，采用自然周期IUI。于月经周期第7～9天采用阴道超声诊断仪(阴道探头频率为5.0 MHz)连续监测卵泡发育情况和子宫内膜发育情况。对于有排卵障碍、月经周期不规律的患者采用人工周期IUI。采用枸橼氯米芬(高特制药，塞浦路斯) 、来曲唑(江苏恒瑞) 、促性腺激素(Gn)或者联合使用诱导排卵，具体剂量根据患者的个体差异决定，月经周期第10～12天开始通过阴道超声连续监测卵泡发育情况和子宫内膜发育情况，根据卵泡监测结果调整来曲唑或Gn用量。

2.精液处理：根据世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册第五版的标准[10]进行精液标本采集及分析。男方在禁欲3～7 d后，采用手淫法采集精液，置于37 ℃、二氧化碳培育箱里液化后用密度梯度离心法处理精液，制备0.5～1.0 ml 精液用于AIH。

3.夫精宫腔内人工授精(AIH)及黄体支持：患者排空膀胱后，取膀胱截石位，行外阴常规清洗和消毒后铺无菌巾，用棉球和生理盐水擦净宫颈，置阴道窥器，暴露宫颈，用一次性注射器将0.5～1.0 ml精子混悬液体通过一次性人工授精管缓缓注入宫腔，精液推注完毕后导管停留2～3 min后退出。术后嘱患者适当抬高臀部，仰卧休息30 min后自行离开。优势卵泡直径达16 mm后自发排卵者当日立即行AIH。优势卵泡直径达到18～20 mm或监测到尿黄体生成素(LH)>45 U/L 时，肌肉注射HCG(珠海丽珠)5 000～10 000 U，24～36 h后行AIH，48 h后阴道超声检查监测排卵情况，如还未排卵，根据监测排卵情况补做1次。排卵后当日开始给予肌肉注射黄体酮(浙江仙琚)20～40 mg/d进行黄体支持，连续用药15 d。妊娠后继续使用至术后8周逐渐减量停药，若排卵前雌激素水平较低或子宫内膜厚度<8 mm，则于黄体酮进行黄体支持时同时应用补佳乐(拜耳，德国)1～2 mg/d。

4.妊娠诊断及随访：人工授精后第16天测血HCG，当血HCG>5 U/L时为HCG阳性，人工授精后第35天B超发现孕囊和原始心管搏动确诊为临床妊娠；临床妊娠包括宫内妊娠和异位妊娠，宫腔内未探及孕囊而附件区探及孕囊或包块回声为异位妊娠；活产指至少有1个妊娠28周后出生的存活婴儿；流产指妊娠不足28周、胎儿体重不足1 000 g而终止妊娠。所有妊娠患者均随访至分娩。

5.观察指标：主要观察指标为临床妊娠率，次要指标为异位妊娠率、活产率和流产率。临床妊娠率=临床妊娠周期数/AIH周期数×100%，异位妊娠率=异位妊娠周期数/临床妊娠周期数×100%，活产数=活产周期数/AIH周期数×100%，流产率=流产周期数/临床妊娠周期数×100%。

三、统计学分析

采用SPSS 26.0软件进行数据统计学分析。计数资料用频数(率)[n(%)]表示，组间比较采用卡方(χ2)检验；非正态分布的计量资料用中位数和四分位间距[M(P25，P75)]表示，组间比较采用The Mann-Whitney U 检验；采用二元Logistic回归分析不同年龄段卵巢储备功能对AIH妊娠结局的影响，计算比值比(OR)、调整后比值比(aOR)及95%CI。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、患者一般资料比较

年龄是影响卵巢储备功能的重要因素，一般认为35岁是卵泡数量消耗的拐点，因此，根据年龄分为<35岁组(n=6 129)和≥35岁组(n=1 302)。

1.<35岁年龄段：DOR组(n=482)与NOR组(n=5 647)比较，DOR组男女双方年龄、血bFSH水平和自然周期占比均显著高于NOR组(P<0.05)，而BMI、血bLH水平、AMH、AFC、人工周期占比均显著低于NOR组(P<0.05)(表1)。

表1 <35岁不同卵巢储备功能组患者基本情况比较[M(P25，P75)，n(%)]

2.≥35岁年龄段：DOR组(n=417)与NOR组(n=885)比较，DOR组男女双方年龄、血bFSH水平和既往妊娠次数均显著高于NOR组(P<0.05)，而不孕年限、血AMH水平和AFC均显著低于NOR组(P<0.05)，两组间BMI、既往自然流产次数和治疗方案占比均无显著差异(P>0.05)(表2)。

表2 ≥35岁不同卵巢储备功能组患者基本情况比较[M(P25，P75)，n(%)]

二、不同卵巢储备功能患者AIH助孕结局的年龄分层分析

在<35岁年龄段中，DOR组的临床妊娠率(10.2% vs. 16.5%)、流产率(0.0% vs. 13.4%)和活产率(10.2% vs. 13.9%)均显著低于NOR组(P<0.05)，而两组间异位妊娠率比较无显著差异(P>0.05)，其中NOR组929例临床妊娠中出现1例孕晚期死胎引产；在≥35岁年龄段中，两组间临床妊娠率、异位妊娠率和活产率比较均无显著差异(P>0.05)，而DOR组的流产率(0.0% vs. 30.8%)显著低于NOR组(P<0.05)(表3)。

表3 不同卵巢储备功能组患者AIH妊娠结局的年龄分层分析(%)

仅以年龄组比较，与<35岁组相比，≥35岁组的临床妊娠率(16.0% vs. 9.4%)及活产率(13.6% vs. 7.1%)显著降低，而流产率(12.7% vs. 23.0%)显著升高(P<0.05)(表3)。

三、不同年龄段患者临床妊娠率和活产率的Logistic回归分析

Logistic回归分析发现，在<35岁年龄段中，在矫正混杂因素如男女双方年龄、女性BMI、不孕年限、治疗方案前，DOR患者的临床妊娠率[OR=0.58，95%CI(0.42，0.78)，P<0.001]、活产率[OR=0.70，95%CI(0.52，0.96)，P=0.024]均显著低于NOR患者(P<0.05)；在矫正各种混杂因素后，DOR患者的临床妊娠率显著低于NOR患者[aOR=0.68，95%CI(0.50，0.94)，P=0.019]，而两组间活产率比较无显著差异(P>0.05)(表4)。

表4 <35岁患者临床妊娠率和活产率的Logistic回归分析

Logistic回归分析发现，在≥35岁年龄段中，在矫正混杂因素前、后，DOR患者与NOR患者间临床妊娠率和活产率比较均无显著差异(P>0.05)(表5)。

表5 ≥35岁患者临床妊娠率和活产率的Logistic回归分析

讨 论

近年来，社会压力的增加、生育年龄的推迟、环境的恶化等多种因素威胁着女性生殖健康，导致女性卵巢储备功能下降、生育困难甚至不孕。ART的快速发展为DOR不孕患者带来了生育的希望。辅助生殖方法的选择至关重要，其中AIH方法简单便捷、创伤性小，在临床上广泛应用，但因其受多种因素影响，目前临床妊娠率仍较低[12]。本研究通过探讨卵巢储备功能对AIH妊娠结局的影响，为DOR患者选择合适的助孕方案提供参考。

女性生育能力从30岁开始下降，35岁之后卵巢储备功能急剧下降，美国妇产科医师学会及美国生殖医学会建议年龄>35岁的女性应该在超过6个月自然受孕失败的情况下尽快进行生育力评估并接受治疗[13]。高龄女性在控制性促排卵(COH)过程中卵巢反应较差，相较于青年女性表现为低妊娠率、高妊娠丢失率、高妊娠并发症发生率等不理想的妊娠结局[14]。本研究结果同样发现，≥35岁时患者在接受AIH助孕后临床妊娠率及活产率显著低于<35岁患者，而流产率显著增高(P<0.05)。然而，女性的实际年龄与卵巢状态并不相符，临床存在一些即使年龄较大但卵巢储备功能依然良好的女性，而青年女性也可发生DOR。Zhang等[15]研究发现，低AMH水平的年轻女性行IVF-ET后的妊娠结局显著优于高AMH水平的高龄女性。随着女性年龄的增长，卵巢内原始卵泡池不断消耗导致卵泡数量减少，同时造成内分泌环境紊乱以及损伤，不断积累导致卵母细胞质量下降，可能是造成高龄女性DOR的主要原因[16]，而青年女性过早减退的卵巢储备功能尚无统一解释。有研究发现，<38岁DOR患者行IVF后，虽然活产率显著降低，但其胚胎形成率、非整倍体率以及整倍体胚胎移植活产率与卵巢储备功能正常(NOR)患者比较无显著差异[17]。相反，另一项研究发现，在调整年龄因素后，DOR患者囊胚整倍体率显著降低，表明卵母细胞质量随数量的减少而降低[18]。高龄女性和青年女性发生DOR的分子机制不同，对ART治疗后妊娠结局的影响也不同。因此，在分析卵巢储备功能对妊娠结局的影响时，应考虑年龄对妊娠结局的影响。

AMH为肽类生长因子，属于转化生长因子β(TGF-β)超家族的成员之一，主要由窦前卵泡及早期窦状卵泡的颗粒细胞分泌，其水平能反映窦卵泡池的大小[19]，且不随女性月经周期发生变化[20]，能更稳定、更敏感地反映卵巢储备功能程度。国内外多项研究按照AMH划分卵巢储备功能，分析助孕结局。Wang等[21]通过一项横断面研究分析了204例接受控制性卵巢刺激治疗的AIH患者的妊娠结局，发现无论患者年龄大小，血AMH水平低时临床妊娠率也较低。在其他研究中有着类似结论[22-23]。与之相反，Seckin等[24]一项回顾性研究发现，无论对于青年患者还是高龄患者，AMH水平都不能预测其IUI妊娠结局。有研究发现，对于行AIH助孕的<35岁患者，无论是自然周期还是人工周期，低AMH水平(<1.0 ng/ml)与高AMH水平(≥1.0 ng/ml)的妊娠结局相似[8]。虽然AMH是与卵巢储备功能相关性最强的标志物，其也有一定局限性[25]，并且在预测IUI妊娠结局方面单独应用AMH的预测价值并不优于年龄、AFC、bFSH[23]。实际上，每种单一指标预测卵巢功能都有一定局限性，实际年龄和卵巢生物学年龄可能不相符，bFSH水平测定要求在月经早期，而基础AFC易受到操作者主观因素的影响。在临床中仍需结合多个指标来对患者的卵巢储备功能进行评估，进而评估卵巢储备功能对ART的影响。

目前，对DOR的诊断尚无国际统一标准，许多研究应用2011年欧洲人类生殖和胚胎学会对卵巢反应不良制定的Bologna标准[26]中的卵巢储备异常试验来诊断DOR，即AFC<5～7个或AMH<0.5～1.1 ng/ml。本研究依据2015年美国疾病控制和预防中心诊断DOR的标准，将FSH>10 U/L和(或)AMH<1.0 ng/ml的女性纳入DOR组。本研究结果发现，无论患者的年龄大小，DOR组的异位妊娠率与NOR组比较无显著差异(P>0.05)。Logistic回归分析发现，在矫正各种混杂因素后，在<35岁的青年女性中，DOR组的临床妊娠率显著低于NOR组(P<0.05)，而两组间活产率比较无显著差异(P>0.05)；对于≥35岁的高龄女性，卵巢储备功能对临床妊娠率、活产率无显著影响(P>0.05)。一项回顾性研究发现，DOR是行IVF-ET后发生异位妊娠的独立危险因素[27]；另一项以AMH<1.0 ng/ml和(或)FSH>10 U/L为DOR诊断标准的研究也得出同样结论[28]。Tiegs等[8]研究发现，在IUI周期中，DOR组与NOR组的异位妊娠率及临床流产率无显著差异。但本研究发现，NOR患者的流产率显著高于DOR患者(P<0.05)，可能是由于DOR组周期数相对过少且临床妊娠率低导致次要观察指标例数更少，DOR组甚至无流产周期。

本研究首先通过年龄分层进行亚组分析，充分排除年龄对卵巢储备功能以及妊娠结局的影响，并进一步矫正了男女双方年龄、女方BMI、治疗方案等可能影响妊娠结局的多种因素，使结果更具说服力。由于本研究为回顾性分析，其固有偏倚可能影响研究结果；其次受到纳入研究数量的限制，DOR组的周期数较少，卵巢储备功能对流产、异位妊娠等不良妊娠结局的影响尚不能形成明确结论，还需后期进一步扩大样本量研究；最后，本研究缺少一些男方资料如BMI、精液分析数据，今后补全这方面资料可能会使我们的研究更加完善。

综上所述，我们的研究结果提示，在AIH周期中，<35岁DOR患者的临床妊娠率较低，对于这类人群应根据患者具体情况尽快计划妊娠，避免发展为早发性卵巢功能不全等疾病；对于≥35岁DOR患者，卵巢储备功能对AIH临床妊娠率无显著影响，但无论卵巢储备功能如何，均表现为低临床妊娠率，应尽早进行快速生育力评估并接受个体化助孕治疗。