秦志华，蔡晴霞，王建琳，王述柏，谭子超，张林林，郭 沛，单 虎

（1青岛农业大学动物医学院，山东 青岛 266109；2青岛农业大学动物科技学院，山东 青岛 266109）

0 引言

构树又称楮树[1]，其嫩枝、叶、根、皮和果等富含蛋白质、脂肪、粗纤维、多糖等营养物质[2]，富含生物碱、黄酮类、多酚类、木脂素类、萜类挥发油类等多种活性物质[3-4]，具有抗氧化、抗菌、增强免疫力、抗病毒等功效[5]，既可用于畜禽饲料，又可入药[6-7]。构树因其独特的营养和药用价值近年来备受国内外学者关注，研究报道较多。据报道构树叶提取物中含有大量黄酮类化合物，是其主要活性成分，极具开发价值[8-10]。目前用于提取黄酮类化合物的方法有加热回流提取法、微波辅助提取法、超声波提取法等[11]。据报道乙醇加热回流提取法具有设备简单、易操作、提取充分等优点，但不适合不耐热成分的提取，对溶剂要求量大，提取时间较长[12-14]。不同植物中黄酮类化合物的提取工艺条件不尽一致[15-16]。李全国[17]报道采用乙醇回流法提取枣叶中总黄酮的最佳工艺条件为乙醇浓度50%、料液比1:10、回流时间1.0 h、提取温度70℃，在此条件下得到的总黄酮提取量为14.31 mg/g。许中畅[18]报道采用乙醇回流提取法提取向日葵花盘总黄酮的最佳工艺条件为乙醇浓度80%、料液比20:1(mL:g)、提取温度80℃、提取时间2 h，总黄酮提取量为25.32 mg/g。陈况况[19]研究显示，采用加热回流法提取水芹中黄酮类的最佳工艺为料液比1:25、乙醇浓度70%、加热时间2.5 h、温度73.8℃，总黄酮提取量为31.5 mg/g DW。有关构树叶采用乙醇加热回流法的提取工艺报道较少。因此，本试验对乙醇加热回流法提取构树叶黄酮类化合物的提取温度、时间、乙醇浓度、料液比等条件进行了筛选优化，在此基础上进一步采用正交试验设计对构树叶黄酮的提取工艺进行了优化，旨在建立一种构树叶总黄酮的高效、便捷提取工艺，从而为其开发利用提供科学方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 构树叶粉末（过40目筛）；芦丁标准品（购自索莱宝生物科技有限公司）；无水乙醇、硝酸铝、亚硝酸盐、氢氧化钠（分析纯，天津恒兴化学试剂制造有限公司）。试验于2017年4—6月在青岛农业大学动物医学院实验室进行。

1.1.2 主要仪器 AR2140电子分析天天平（上海奥斯豪国际贸易公司）；RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；WFZ754型紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；KDM电子调温电热套（龙口市先科仪器有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 芦丁标准曲线的制作 芦丁标准品加少量无水乙醇溶解，70%乙醇溶液定容，即得芦丁标准品溶液。根据NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法检测510 nm下不同浓度芦丁标准品溶液的吸光值[20]。制作的标准曲线见图1，回归方程见式(1)。

图1 芦丁标准曲线

1.2.2 单因素试验设计筛选最优提取条件 采用单因素试验设计，分别研究不同乙醇浓度、反应时间、反应温度、液料比条件下的构树叶总黄酮提取量，筛选最优条件。

乙醇浓度：以乙醇为溶剂，提取浓度分别设置为：50%、60%、70%、80%、90%。其他提取条件一致：料液比为1:20(g:mL)，反应温度50℃，反应时间1 h。单因素试验结果显示最佳乙醇添加浓度为70%。

反应时间：反应时间分别设置为：1、1.5、2、2.5、3 h。其他提取条件一致：以70%乙醇为溶剂，料液比为1:20(g:mL)，反应温度为50℃。单因素试验结果显示最佳反应时间为2.5 h。

反应温度：反应温度分别设置为：40、50、60、70、80℃。其他提取条件一致：以70%乙醇为溶剂，料液比为1:20(g:mL)，加热回流反应时间2.5 h。单因素试验结果显示最佳反应温度为70℃。

料液比：料液比分别设置为1:20、1:25、1:30、1:35、1:40(g:mL)。其他提取条件一致：以70%乙醇为溶剂，反应温度70℃，反应时间2.5 h。单因素试验结果显示最佳料液比为1:30。

上述试验均采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法测定OD值，根据1.2.1标准曲线计算总黄酮含量。

1.2.3 提取工艺优化试验 根据1.2.2单因素试验获得的最佳参数，以乙醇浓度(A)、反应时间(B)、反应温度(C)、料液比(D)为考察因素，每种因素设置3个水平，采用正交试验设计L9(34)（见表1）研究最佳提取工艺，以提取液中总黄酮含量为评价指标。

表1 加热回流法提取工艺的四因素三水平正交试验设计

1.2.4 最佳工艺重复验证试验 对1.2.3获得的最佳工艺进行验证：称取1.0 g构树叶粉末，在最佳提取工艺条件下进行总黄酮提取，重复5次，检测提取液中总黄酮含量。

1.2.5 最佳工艺放大试验 称取10.0 g构树叶粉末，采用1.2.3获得的最佳提取工艺进行总黄酮提取，重复5次，检测提取液中总黄酮含量。

1.3 数据处理与统计分析

采用Excel 2016软件初步整理试验数据，采用SPSS 22.0软件进行回归分析和正交试验数据分析。

2 结果与分析

2.1 不同提取条件对构树叶中总黄酮提取量的影响

2.1.1 不同乙醇浓度对总黄酮提取量的影响 不同乙醇浓度对总黄酮提取量的影响见图2。如图2所示，随着乙醇浓度的增加，构树叶总黄酮的提取量呈先上升后下降趋势，总黄酮提取量达到峰值的乙醇浓度为70%。剂量-效应回归方程见式(2)。计算得知：乙醇浓度为71.95%可获得最佳提取量，接近于设定值70%。

图2 不同乙醇浓度对总黄酮提取量的影响

2.1.2 不同反应时间对构树叶中总黄酮提取量的影响不同反应时间对构树叶中总黄酮提取量的影响见图3。如图3所示，反应时间在1～2.5 h范围内，构树叶总黄酮提取量随时间的增加呈增加趋势，反应时间2.5 h总黄酮提取量达到峰值，之后开始下降。剂量-效应回归方程见式(3)。计算得知：反应时间2.58 h可获得最佳提取量，接近于设定值2.5 h。

图3 不同反应时间对总黄酮提取量的影响

2.1.3 不同反应温度对构树叶中总黄酮提取量的影响不同反应温度对构树叶中总黄酮提取量的影响见图4。如图4所示，反应温度在40～70℃范围内，随温度升高构树叶总黄酮提取量呈上升趋势，70℃时提取量达到峰值，之后呈下降趋势。剂量-效应回归方程见式(4)。计算得知：反应温度70.88℃可获得最佳提取量，接近于设定值70℃。

图4 不同反应温度对总黄酮提取含量的影响

2.1.4 不同料液比对构树叶中总黄酮提取量的影响 不同料液比对构树叶中总黄酮提取量的影响见图5。如图5所示，随着料液比增加，构树叶总黄酮提取量呈迅速增多而后下降趋势，料液比为1:30(g/mL)时，总黄酮提取量达到峰值。剂量-效应回归方程(5)。计算得知：料液比1:29可获得最佳提取量，接近于设定值1:30。

图5 不同料液比对总黄酮提取含量的影响

2.2 不同提取工艺对构树叶总黄酮提取量的影响

不同提取工艺对构树叶总黄酮提取量的影响见表2。由表2可知，各因素对构树叶总黄酮提取量的影响大小顺序为：A＞B＞C＞D，最佳提取条件为：A2B2C3D2。方差分析结果见表3，从统计学角度看，试验数据具有统计学意义，因此确定最佳提取工艺条件为：乙醇浓度70%，反应时间2.5 h，反应温度80℃，料液比1:30。

表2 不同提取工艺对构树叶总黄酮提取量的影响

表3 方差分析

2.3 最佳提取工艺的重复验证试验结果

最佳工艺条件重复验证试验结果显示，自1 g构树叶提取获得的提取液样品中构树叶总黄酮含量为23.11 mg/g，RSD=0.90%。高于正交设计结果中的最大值，表明所确定的提取工艺稳定性和可靠性良好。

最佳工艺放大试验结果显示，自10 g构树叶提取获得的提取液样品中构树叶总黄酮含量为23.13 mg/g，与放大前试验提取量一致，进一步验证了所确定的提取工艺具有良好稳定性和可靠性。

3 讨论

加热回流提取法利用乙醇等有机溶剂对样品中的有效成分进行提取，溶剂沸点决定反应温度，加热回流提取反应时间较长，有利于样品与溶剂充分接触，使目标物质充分浸出，但长时间高温易使有效成分失活[21]。

大量研究表明采用加热回流法提取植物中黄酮类化合物的提取工艺因植物种类不同，工艺条件不尽一致。向蓉等[15]报道，采用加热回流法（乙醇浓度60%、加热温度88℃、回流反应时间4 h，反复2次）提取辣蓼总黄酮，发现该提取工艺的提取率优于索氏提取法和热水提取法，与超声提取法相差不大，但加热回流提取时间长，能耗较大。赵雪梅等[22]报道常山胡柏皮中黄酮类化合物的最佳提取工艺参数为反应时间150 min，乙醇浓度80%、反应温度20℃，料液比1:5，最大提取量1.98 mg/mL。张帆等[23]研究表明，采用乙醇加热回流法提取芒果叶中总黄酮的最佳工艺为温度100℃，时间2 h，液固比10，提取次数3次。目前构树叶总黄酮提取工艺的研究较少。汪雁等[24]以离子液体苯并噻唑甲烷磺酸盐为提取剂，结合超声辅助提取构树叶总黄酮，通过条件优化后测得总黄酮含量为0.46 mg/g，该法操作复杂，得率较低。张志鹏等[25]研究发现采用加热回流法提取航天杂交构树叶总黄酮的最佳提取工艺为乙醇浓度70%、料液比1:20(g:mL)、反应时间6 h、反应温度100℃。本试验结果显示，采用乙醇为溶剂最佳浓度为70%，最佳反应时间为2.5 h、最佳料液比为1:30(g:mL)、最佳反应温度为80℃，重复验证和放大验证试验显示，本试验的提取工艺具有良好的稳定性、提取得率较高，与上述报道比较，反应时间缩短、反应温度较低。

4 结论

本试验以构树叶为原料，采用单因素和正交试验优化后得到的加热回流法提取构树叶总黄酮的最优工艺为：乙醇浓度70%、反应温度80℃、提取时间2.5 h、料液比1:30(g:mL)。