张佳琦，郭宗珊，刘长华，李荣田

（1黑龙江大学现代农业与生态环境学院，哈尔滨 150080；2黑龙江大学生命科学学院，黑龙江省普通高等学校分子生物学重点实验室，哈尔滨 150080）

0 引言

黑龙江省是中国六大水稻种植区之一，也是世界上最寒冷的稻作区。水稻在黑龙江省种植区域较广，覆盖了5个积温区，品种类型多样，包括普通粳稻、糯稻、香稻、香糯、软米和旱稻等类型[1-2]。尽管审定通过的品种较多，但生产上当家品种还是‘龙粳31’、‘绥粳18’、‘龙稻 18’、‘松粳 9’和‘稻花香 2 号’等经典品种[3]，新品种与老品种相比，在性状方面的差异不显著，缺乏突破性品种。造成寒区水稻品种徘徊局面的主要原因是早粳稻种质资源匮乏，遗传基础狭窄。少数骨干亲本被反复应用于育种实践，导致新品种和老品种基因组成类似、性状相似。

SSR分子标记，即微卫星序列，是由1～6 bp基序组成的重复序列，在真核生物中普通存在[4]。因SSR多态性好、稳定可靠和重复性好，已被广泛应用于作物品种鉴定、遗传多样性分析和遗传图谱构建等领域[5]。张全芳等[6]利用48个SSR标记，分析了山东省育成和审定的48份水稻品种，发现其遗传多样性不够丰富，品种间的亲缘关系较近。董俊杰等[7]利用214个分子标记分析了来自14个国家的273份水稻材料，发现具有丰富的遗传变异。宋泽等[8]对173份贵州糯稻品种，利用SSR标记进行了遗传多样性分析，结果表明供试材料遗传背景相似程度较高。刘丹等[9]利用45个SSR分析了黑龙江省的粳稻资源，结果表明黑龙江省农科院黑河分院材料与其他单位粳稻品种亲缘关系较远，但与黑龙江农业科学院佳木斯水稻研究所的材料亲缘关系较近。另外，目前还在小麦[10]、玉米[11]、马铃薯[12]、甜菜[5]和花生[13]等多种作物中利用SSR标记技术构建了DNA指纹图谱。因此，利用SSR分子标记分析水稻种质资源的遗传多样性，了解种质资源的遗传背景和亲缘关系，其结果可指导杂交育种亲本选择，避免育种的盲目性，提高育种效率。为了探明黑龙江省近年来主栽水稻品种及新育成品种遗传多样性，本研究利用农业行业标准《水稻品种鉴定技术规程SSR标记法(NY/T 1433—2014)》中公布的SSR标记检测寒区231份水稻品种的DNA指纹图谱，根据遗传距离的聚类结果确定品种间的亲缘关系，为培育寒区突破性水稻品种提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 水稻材料

本研究选用的231份水稻材料系黑龙江省近年来主栽品种及2019年参加省品种审定区域试验及生产试验的部分水稻品种。这些水稻覆盖黑龙江省第一至第五积温区（表1）。将231份水稻的种子于2019年生长季节在黑龙江大学呼兰校区水稻试验田进行旱育苗插秧栽培，插秧规格为行距30 cm、株距12 cm、每蔸插2～5棵秧苗。田间水稻材料顺式排列，2行区，行长3 m，小区面积1.8 m2。田间种植及管理同大田，于同年9月15日收获种子。秋天每份水稻材料选择典型植株取叶片，用于DNA抽提及SSR检测。

表1 供试水稻品种及其适应区域

续表1

1.2 SSR分子标记

研究选用《中华人民共和国农业行业标准水稻品种鉴定技术规程SSR标记法》(NY/T 1433—2014)中公布的分布于12条染色体的47个SSR标记来检测供试的231份水稻品种的基因型。SSR标记信息见表2。

1.3 基因组DNA提取及PCR检测

采用CTAB法提取水稻叶片DNA[14]，使用Nano Drop2000超微量分光光度计检测DNA浓度及纯度，保证OD260/280值≥1.8，浓度≥20 ng/μL，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。

PCR反应体系：水稻模板DNA 1 μL，正向引物0.5 μL(10 μmol/L)，反向引物 0.5 μL(10 μmol/L)，2×TaqPCR Master Mix 3 μL，ddH2O 5 μL，总 体 积 为10 μL。

PCR扩增程序：94℃，3 min；94℃变性30 s～56℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，30 循环；72℃，8 min；4℃储存。PCR完成后，扩增产物采用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。

1.4 数据统计与分析

在DNA电泳图谱中，在同一迁移位置，列出二元数据矩阵：有DNA扩增带的记为“1”，无扩增带的记为“0”。用Excel2013整理SSR电泳结果，按照不同的软件要求转换数据格式。利用PowerMarker V3.25软件计算每个位点等位基因数、基因多样性、多态性信息量(PIC)和标记指数(MI)[15]；利用MEGA4.0软件计算遗传距离，按UPGMA方法进行聚类分析，构建系统发育树[16]。利用Gen ALEx软件进行主坐标分析并构建二维主坐标分析图[17]。

2 结果与分析

2.1 SSR标记多样性

47个SSR在供试的231份水稻均能检测到清晰、稳定的条带，其中分子标记RM583对部分水稻品种检测结果如图1所示。由图1A可见，M583标记共有3种带型，针对每个水稻材料可得到“01”型DNA指纹图谱（见图1B）。

图1 水稻品种1号～32号分子标记RM583电泳图(A)及其DNA指纹(B)

47个SSR标记检测231份水稻品种的多态性结果见表2。由表2可知，47个SSR标记在231份水稻中共检测到136个等位基因，等位基因数变异范围为2～5个，平均为2.92个；基因多样性变幅为0.11～0.79，平均为0.56；多态性信息量PIC值变化范围0.11～0.76，平均为0.49；标记指数MI变化范围为3.18～18.39，平均为6.52。其中，分子标记RM224检测到的等位基因数最多（5个），相应地PIC值最高(0.76)，而RM274检测到的等位片段数最少（2个），PIC值也最低(0.11)。

表2 47个SSR标记位点在231份水稻中的遗传多态性

续表2

47个SSR标记对231份水稻品种多态性检测结果在不同连锁群上的表现如图2。图2显示，不同的连锁群上分子标记多态性不同，连锁群11分子标记等位基因数最高，连锁群5和连锁群6较低；不同连锁群PIC值大小存在差异，连锁群8PIC值最大，连锁群5PIC值最低。从图2还可知，通常分子标记等位基因数高的连锁群，其PIC值往往也高，但是二者并不是一对一的关系。这些结果表明，供试的水稻品种（系）每条染色体上分子标记的多态性均较好，选用的47个SSR标记能够较好地反映供试的水稻品种遗传变异情况。

图2 231份水稻品种不同连锁群平均等位基因数和平均PIC值

2.2 DNA指纹图谱构建

47个SSR标记对黑龙江省水稻‘松粳9’、‘龙稻18’、‘稻花香2号’、‘绥粳18’和‘龙粳31’等5个代表性品种构建的DNA“01”数字图谱见表3（其他品种DNA数字图谱略）。由表3可知，每个水稻品种都有一串独特的136位的“01”型的数字符，是唯一的有别于其他品种的数字图谱，可视为该品种的“分子身份证”，可用于进行水稻品种真伪鉴别及分析不同品种间的差异大小。

表3 代表性水稻品种DNA指纹图谱

2.3 聚类分析

依据47个SSR标记对231份水稻品种检测获得的DNA“01”数字图谱，利用MEGA4.0软件计算遗传距离，按UPGMA方法聚类的结果如图3所示。由图3可知，231份水稻品种划分为3大类7个群。类1包括群1、群2和群3等3个群，共89份材料；类2包括群4、群5和群6等3个群，共136份材料；类3最小，只有群7，包括6个品种。

图3 231份水稻品种基于遗传距离的UMPGA聚类结果

对各类群品种进一步分析的结果见图4。图4显示，群1，以积温区Ⅲ品种为主，积温区Ⅲ品种占比65.52%，群1包括‘龙粳31’等品种共29个；群2，以积温区Ⅱ和积温区Ⅲ品种为主，积温区Ⅱ品种比例为24.14%，积温区Ⅲ品种比例为37.93%，积温区Ⅱ和积温区Ⅲ品种占比62.07%，群2包括‘龙科10’和‘丰硕3’等品种共29个；群3，以积温区Ⅲ品种为主，积温区Ⅲ品种比例61.29%，群3包括‘飞凡9’等31个品种。群4，积温区Ⅰ品种最多，占该品种总数的50.00%，群4包括‘哈粳稻9号’品种在内共58个品种；群5，以积温区Ⅰ、积温区Ⅱ品种为主，积温区Ⅰ品种比例为35.29%、积温区Ⅱ品种比例为23.53%，积温区Ⅰ和积温区Ⅱ品种占比58.82，群5包括‘五优稻1号’和‘鸿源5号’等17个品种；群6，积温区Ⅰ品种占比最多(47.54%)，包括‘稻花香2号’、‘龙稻18’等61个品种，是最大的群。类3只有1个群，即群7，只有‘龙洋16’等6个品种，是最小的群。群7各个品种未划归类1和类2中，单独成为一类，说明该6个品种与其他品种遗传距离相对较远。比较分析类1和类2的水稻品种，类1中以北部积温区Ⅲ品种为主，类2中以南部积温区Ⅰ品种为主。说明，黑龙江省北部水稻主产区的积温区Ⅲ的不同水稻品种遗传差异较小，南部优质稻米产区的积温区Ⅰ的不同水稻品种遗传差异较小，北部积温区Ⅲ品种与南部积温区Ⅰ品种遗传差异相对较大。

图4 不同类群水稻品种在各积温区分布图

根据47个分子标记的分型结果，用Gen ALEx软件构建231份水稻品种的二维主坐标分析图（图5）。以第1主成分和第2主成分为二维坐标图的坐标，第1主成分和第2主成分分别反映了10.74%和9.87%的变异。主坐标图上的距离远近代表着各个水稻材料之间的亲缘关系。从图5可以看出，231份水稻明显分成两大类，一类主要包括a、b、c等3个群，另一类由e、f、g等3个群组成。d、f和g群的少数品种介于2类之间。主成分分析结果与聚类分析结果基本一致。

图5 231份水稻品种的主坐标分析(PCA)二维散点图

3 讨论

DNA标记位点的平均PIC值，可被用来估算群体的遗传多样性水平，群体的平均PIC值越高，表明群体的DNA标记位点变异程度越高，群体的遗传多样性越丰富[18-19]。张全芳等[6]利用48个SSR标记，分析了山东省育成和审定的48个水稻品种（系），SSR标记的PIC平均为0.26，山东省育成和审定的水稻品种（系）遗传多样性不够丰富。从夕汉等[20]利用29个SSR标记分析东南亚62个水稻品种，平均多态信息含量为0.52，同一来源地的品种遗传基础较狭窄。李松等[21]利用18个SSR标记分析腾冲本地糯谷和推广种植的品种间的遗传多样性，SSR的PIC平均值为0.63，腾冲糯谷与推广种植水稻品种间遗传基础丰富。本研究中，47个SSR标记在231份水稻检测到有效等位基因数为136个，平均每个位点检测到的等位基因数为2.92个，基因多样性变幅为0.11～0.79（平均为0.56），平均PIC值为0.49，该结果高于张全芳等[6]的(PIC=0.26)研究结果，低于从夕汉等[20](PIC=0.52)和李松等[21](PIC=0.63)的PIC值，说明寒区当前水稻品种遗传多样性不够丰富。以后，在水稻育种进程中，应加强引进亲缘关系较远、性状优良的水稻种质资源用作杂交亲本，提高黑龙江省的粳稻遗传多样性。

近年来，育种家们普遍利用分子标记研究群体的遗传距离和遗传多样性[22-24]。束爱萍等[25]发现水稻品种之间的遗传差异与纬度和地理位置有很大的关系。马作斌等[26]研究表明所处纬度相近的国家或地区的水稻品种之间的遗传距离较近，而所处纬度较远的国家或地区的水稻品种遗传距离较远。玄英实等[27]研究表明地理位置相对较近的品种，具有较近的亲缘关系；地理位置相对较远的品种，则具有较远的亲缘关系。本研究显示，231份寒区水稻材料被分为3大类7群。类1中的群1、群2和群3均以积温区III品种居多，积温区III品种间具有较近的亲缘关系。类2中群4和群6是主要的品种集，均以积温区I品种占比最多，积温区I品种间具有较近的亲缘关系。这与玄英实等的研究结果相符。而黑龙江省北部积温区III的大部分品种与南部积温区I的大部分品种，亲缘关系较远。黑龙江省北部与南部在地理位置上存在差异，气候等生态类型不同，因此大部分品种的亲缘关系较远，这与束爱萍、马作斌等的研究结果相符。

在水稻新品种培育工作中，引进优异种质资源，亲本选配时适当选择遗传距离较远且综合性状差异较大的材料，对培育新型水稻品种具有重要意义[28-29]。赵璐等[30]评价了宁夏及新疆193份水稻种质资源的遗传多样性，并从新疆引进遗传距离较远的水稻作原始材料，有效地拓宽了宁夏水稻种质资源。刘宝海等[31]研究了黑龙江省花培技术培育的粳稻品种亲缘关系，发现寒区花培水稻品种间亲缘关系较近。本研究证明黑龙江省北部水稻品种与南部水稻品种亲缘关系较远，寒区北部积温区III是水稻主产区，代表品种‘龙粳31’等高产性品种，南部积温区I是优质稻米主要生产区域，代表品种‘稻花香2号’及‘龙稻18’等。在黑龙江省今后水稻育种实践中，应该注意利用北部水稻品种与南部水稻品种之间杂交，拓宽遗传背景，培育出绿色优质高产的突破性品种可能性较大。

4 结论

47个SSR分子标记能够将黑龙江省231份水稻品种完全区分开来，寒区水稻品种遗传多样性不够丰富（平均PIC值为0.49），聚类分析将231份水稻分为3类7群。同一积温区不同水稻品种遗传差异较小‘，稻花香2号’等品种主要在第一及第二积温区，但有向第三积温区扩展的趋势。南部优质米产区的积温区I品种与北部水稻主产区积温区III的品种遗传差异较大。黑龙江省今后水稻育种工作中应注意北部品种与南部品种的杂交，利于拓宽遗传背景，培育出绿色优质高产新品种。