姜垦 包旭宏 刘海龙 路杰 张宇

痛风（Gout）是单钠尿酸盐晶体（Monosodium urate，MSU）沉积在关节周围所致的一种炎症，与代谢性疾病高尿酸血症息息相关[1]。据统计[2]，我国痛风发病率为0.86%～2.20%，其中男性患病率远高于女性，并呈逐年增长趋势。目前痛风的治疗重点在于控制尿酸水平，主要包括减轻炎症反应、促进尿酸排泄或抑制尿酸生成[3]。

藏医药是祖国传统医学中的一颗明珠，其有效性已得到越来越多人的认可，藏医药干预痛风以分期论治思想结合病症特点取得了良好效果[4]。痛风片由独一味、决明子、诃子、宽筋藤、黄葵子等八味藏药材组成，是兰州市奇正中藏医医院的经验方，具有祛风止痛、清热利湿的功效，用于湿热瘀阻所致的痛风病。本实验采用正交实验结合信息熵理论优化痛风片的提取工艺，星点设计-效应面法结合总评归一法（OD）优化痛风片的成型工艺，以期为痛风片新药的开发奠定基础。

1 材料

1.1 仪器 电子调温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司）、旋转蒸发仪（瑞士步琪）、立式超纯水机（MOLgene120d，甘肃摩勒科学有限公司）、电子天平（YP-2001N，上海精密科学仪器有限公司）；分析天平（XS205DU，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）、高效液相色谱仪（Agilent 1260，安捷伦科技（中国）有限公司）、BJ-Ⅱ崩解时限仪（天津市光学仪器厂）、PYD-Ⅰ型片剂硬度测试仪（天津市蓝深科技发展有限公司）、CSD-Ⅱ型脆碎度检测仪（天津市蓝深科技发展有限公司），ZPY-9型10冲旋转式压片机（青州市精诚医药装备制造有限公司）。

1.2 试剂与药物 独一味（批号20210428-02）、黄葵子（批号180601）、宽筋藤（批号20030034）、决明子（批号180401-1）、车前子（批号202003001）、诃子（批号2007211）等药材均来源于甘肃奇正藏药有限公司，山栀苷甲酯对照品（批号111873-202004）、8-O-乙酰山栀苷甲酯对照品（批号111872-201703）均来源于中国食品药品检定研究院。

淀粉、微晶纤维素、糊精、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁、交联聚维酮均为药用规格；乙腈为色谱纯[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；其他均为分析纯（成都市科隆化学品有限公司）；水为纯化水。

2 方法

2.1 山栀苷甲酯、8-O-乙酰山栀苷甲酯含量测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱为安捷伦Ecplise Plus C18柱（4.6×250mm，5.0μm），流动相为乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0～10min，8%→10%A；10～25min，10%A；25～29min，10%→14%A；29～45min，14%→16%A；45～55min，16%→20%A；55～60min，20%→80%A）流速为1ml/min，检测波长235nm，柱温30℃，进样量为10μl。

2.1.2 对照品溶液制备 精密称定山栀苷甲酯对照品10.64mg、8-O-乙酰山栀苷甲酯对照品11.04mg置于25ml容量瓶中，以色谱甲醇溶解定容，摇匀，超声处理作为山栀苷甲酯、8-O-乙酰山栀苷甲酯对照品储备液。取储备液10、5、2、1、0.5、0.2ml分别定容至10ml容量瓶中，超声、摇匀，得到不同浓度的混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液制备 精密称定1g水提浓缩液真空干燥物，精密移取25ml 70%甲醇，水浴加热回流1h，放冷，用70%甲醇补足失重，用0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液，即可获得供试品溶液。

2.1.4 阴性供试品溶液制备 对不含独一味药材的痛风片处方加8倍水回流提取3次，每次0.5h，合并滤液，减压浓缩至100ml，真空干燥，粉碎至过4号筛，按“2.1.3”项下方法制备缺独一味的阴性对照品溶液。

2.1.5 专属性实验 精密吸取上述供试品溶液、混合对照品溶液、阴性供试品溶液各10μl，按“2.1.1”项下色谱条件进样，色谱图见图1，结果阴性无干扰，表明专属性良好。

图1 痛风片提取液中山栀苷甲酯、8-O-乙酰山栀苷甲酯高效液相色谱图

2.1.6 线性关系考察 精密吸取“2.1.2”项下混合对照品溶液10μl，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，以对照品溶液浓度为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归分析，见表1。表明2种指标成分在各自浓度范围内线性关系良好。

表1 2种成分线性关系考察结果

2.1.7 精密度试验 精密吸取“2.1.2”项下32.89μg/ml的山栀苷甲酯与31.90μg/ml的8-O-乙酰山栀苷甲酯对照品溶液，连续进样6次，计算峰面积的RSD。结果山栀苷甲酯、8-O-乙酰山栀苷甲酯峰面积的RSD分别为0.14%、0.30%。

2.1.8 稳定性试验 取“2.1.3”项下供试品溶液室温放置，分别于0、2、4、6、8、12、24h精密吸取10μl进样分析，结果山栀苷甲酯、8-O-乙酰山栀苷甲酯峰面积的RSD分别为2.40%、1.43%。

2.1.9 重复性试验 按“2.1.3”项下方法制备6份供试品溶液进行测定，结果山栀苷甲酯、8-O-乙酰山栀苷甲酯峰面积的RSD分别为0.58%、1.99%。

2.1.10 加样回收率试验 取已知含量的供试品溶液，分别加入山栀苷甲酯、8-O-乙酰山栀苷甲酯对照品适量，进样分析，计算供试品在低、中、高浓度下山栀苷甲酯的平均回收率分别为104.09%、102.32%和101.54%；8-O-乙酰山栀苷甲酯的平均回收率为94.13%、97.02%和98.95%。

2.2 干膏得率的测定 取90g痛风片配方药材，加适量水煎煮，将回流提取水煎液浓缩、定容至100ml容量瓶中，精密量取25ml置入已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后于105℃烘箱中干燥3h，取出放于干燥器中冷却30min，迅速精密称定重量，计算干膏得率。干膏得率（%）=（含干膏蒸发皿质量-蒸发皿质量）×20/100×100%[5]。

2.3 提取工艺考察

2.3.1 吸水率考察 取处方量饮片3份，每份90g，置于干燥烧杯中，加入500ml蒸馏水，封口，浸泡至药材无白心，称定湿重，计算平均吸水率为206%。吸水率=（湿药材重量-干药材重量）/干药材重量×100%。

2.3.2 正交实验设计 基于传统水煎工艺，选择以水为提取溶剂，经单因素实验确定加水量以原药材的8、10、12倍，提取时间为0.5、1、1.5h，提取次数选择1、2、3次进行正交实验设计，拟定L9（34）正交表进行实验，以山栀苷甲酯、8-O-乙酰山栀苷甲酯的含量、干膏得率为评分指标，采用熵权法对评价指标进行权重系数分配，计算综合评分，确定最佳提取工艺，因素水平见表2。

表2 痛风片提取工艺正交实验因素水平表

2.3.3 正交实验数据处理 权重分析是通过熵权法对各指标的重要性进行权重输出，根据信息熵的定义，对于某项指标，可以用熵值来判断离散程度，其信息熵值越小，指标的离散程度越大，该指标对综合评价的影响（即权重）就越大，因此，可利用信息熵这个工具，计算出各个指标的权重，为多指标综合评价提供依据[6，7]。通过计算，结果见表3。

表3 痛风片提取工艺评价指标权重

根据各指标的权重系数对正交实验数据进行综合评分。综合评分=山栀苷甲酯含量/山栀苷甲酯含量最大值×0.2876×100+8-O-乙酰山栀苷甲酯含量/8-O-乙酰山栀苷甲酯含量最大值×0.3484+干膏得率/干膏得率最大值×0.3639。正交实验见表4，利用方差分析确定最优提取工艺，见表5。

表4 痛风片提取工艺正交实验结果

表5 痛风片提取工艺正交实验结果方差分析

由正交实验结果直观分析得到各因素对痛风片水提工艺最主要因素为煎煮次数（C），其中加水倍数（A）和煎煮时间（B），各因素不同水平影响为A3>A2>A1，B3>B2>B1，C3>C2>C1（其中数字代表因素所对应的水平）。经方差分析发现因素3（提取次数）各水平间差异具有统计学意义（P<0.05），根据实验结果及生产实际确定最佳提取工艺水平组合为A1B1C3，即加8倍量水煎煮3次，每次0.5h。

2.3.4 实验验证 称取处方药材90g，共3份，按“2.3.2”至此项下的优化工艺进行3批实验验证，见表6，表明该工艺稳定可行。

表6 痛风片提取工艺验证结果

2.4 成型工艺研究

2.4.1 片芯制备方法的确定 称取处方药材，加8倍量水煎煮3次，每次0.5h，过滤，合并滤液，喷雾干燥得到浸膏粉，将本品与填充剂过60目筛3遍混合均匀，加入适量的润湿剂制软材，过20目筛挤压制得颗粒，40℃烘干，整粒后与崩解剂和润滑剂混合均匀，即可获得片芯。

2.4.2 填充剂的选择 本品具有吸湿性，长期放置会出现结块现象，选择合适的辅料可以改善主药的吸湿性质，常见的辅料有糖类、淀粉类、纤维素类等。痛风患者常伴有高血压、高血糖等疾病，不宜选择糖类为填充剂，本实验选择淀粉、糊精、微晶纤维素作为制剂的填充剂，按照“2.4.1”项的方法制备片芯，考察不同片芯制得片剂的硬度、脆碎度和崩解时限，见表7。

表7 填充剂筛选结果

实验结果表明，当以糊精、淀粉为填充剂时，脆碎度检测时会出现碎片现象，以微晶纤维素为填充剂时各项均合格，考虑到微晶纤维素价格较高，在微晶纤维素中加入淀粉还能降低脆碎度，故选定微晶纤维素和淀粉为填充剂。

2.4.3 崩解剂的选择 由于中药浸膏片崩解时间较长，故需要加适宜的崩解剂促进崩解。本实验在保持其他辅料不变的情况下，选择羧甲基淀粉钠和交联聚维酮作为崩解剂筛选[8]，见表8。

表8 崩解剂筛选实验结果

实验结果表明，以羧甲基淀粉钠为崩解剂时脆碎度与硬度均好于交联聚维酮，所以选择以羧甲基淀粉钠为崩解剂。同时考察崩解剂的加入方法，发现外加法得到的片剂硬度及碎度均合格，且崩解时限最短，综合考虑选择操作较易的外加法做为崩解剂的加入方法。见表9。

表9 崩解剂加入方法实验结果

2.4.4 润湿剂的选择 本品为中药浸膏粉片，具有较强的粘性和吸湿性，在预实验中发现只需要加入润湿剂，颗粒就具有良好的成型性，经预实验确定95%乙醇为润湿剂。

2.4.5 润滑剂的选择 硬脂酸镁表面积大、易与颗粒混合，粘附性强，使片剂光滑美观，在片剂中作为润滑剂和抗粘剂广泛使用[9]，考察用量对本品休止角、硬度、脆碎度及崩解时限的影响，见表10。可知润滑剂用量对休止角和硬度无明显影响，延长崩解时间，故本实验选择0.2%硬脂酸镁作为润滑剂。

表10 润滑剂筛选

2.4.6 星点实验设计优化片剂处方 在单因素实验筛选的基础上，选择对制剂影响较大的微晶纤维素（MCC）、淀粉、羧甲基淀粉钠（CMS-Na）的用量作为影响因素，以脆碎度（d1）、硬度（d2）、休止角（d3）和崩解时限（d4）的OD值为评价指标[10]，计算公式为OD=（d1×d2×d3×d4）1/4。对于越大越好的指标（如硬度）dn=（Yn-Ymin）/（Ymax-Ymin）；对于越小越好的指标（如脆碎度、休止角和崩解时限）dn=（Ymax-Yn）/（Ymax-Ymin），实验设计因素水平见表11，实验结果见表12。

表11 实验设计因素水平

2.4.7 模型拟合与方差分析 采用Design-Expert10.0.1软件对表12数据进行拟合，得到方程为OD=-2.2115+4.0075A+3.7602B+0.1881C-4.48-42AB+0.0467AC-0.0479BC-0.5007A2-1.4424B2-0.0094C2，方差分析见表13。

表12 实验设计与结果

表13 方差分析

2.4.8 效应面优化与预测 利用Design Expert10.0.1软件得到辅料与浸膏粉比例、淀粉与微晶纤维素比例、崩解剂用量各因素交互OD值的效应面图，见图2。在实验设计的各比例范围内，通过Design Expert10.0.1软件得到痛风片最佳成型工艺：辅料与浸膏粉比例为0.42：1，淀粉与微晶纤维素比例为0.88：1，崩解剂用量为8.29%，OD值为0.7513。结合实际生产操作，将最优成型工艺调整为辅料与浸膏粉比例为0.4：1，淀粉与微晶纤维素比例为0.85：1，崩解剂用量为8%。

图2 3种因素交互OD值的效应面图

2.4.9 实验验证 按优化最佳工艺制备3批痛风片进行验证试验，见表14。由此可知，OD值为0.7260，与预测值的OD值（0.7513）接近，表明模型预测性良好，可用于工艺参数的优化。

表14 实验验证

3 讨论

近年来，藏医药理论发展迅速，其中藏成药在抗痛风方面取得了显著成就。痛风片具有祛风止痛、清热利湿的功效，用于湿热瘀阻所致的痛风病。本方中所含药物较多，煎煮过程中加水量、煎煮时间和煎煮次数等因素都会对复方提取液中活性成分的含量有影响，本实验通过熵权法对多指标成分赋权，得到综合评分，从而筛选最佳提取工艺。

临床疗效是由复方中多种活性成分共同发挥作用的结果，因此评价指标的选择是提取工艺中的重要一环，本实验以痛风片复方中的君药独一味的有效成分与干膏得率为优化指标，朱斌[11]研究发现独一味水提物能够有效抑制慢性疼痛，马文玉等[12]认为独一味镇痛有效物质是环烯醚萜苷类化合物山栀苷甲酯与8-O-乙酰山栀苷甲酯。干膏得率对后续片剂的成型工艺及服用剂量有极大影响，因此本实验选择山栀苷甲酯、8-O-乙酰山栀苷甲酯和干膏得率为评价指标。

中药片剂的成型是个较为复杂的过程，提取物干膏粉的粉体学性质、辅料的种类、制粒方法等[13]均会影响到片剂最终的成型。本方采用水提法，喷雾干燥得到的干膏粉粘性强、流动性差、易吸湿，直接压片不易成型，需要加入适宜的稀释剂和助流剂进行制粒、压片。本实验采用湿法制粒，在预实验中发现以75%、85%的乙醇为润湿剂制软材时易形成团块，出现“死颗粒”，无水乙醇制粒成本较高且干粉较多，最终选择以95%乙醇制粒。在填充剂的选择方面主要以微晶纤维素和淀粉的比例进行筛选。中药浸膏片通常不易崩解，本实验以硬度、脆碎度和崩解时限为指标考察羧甲基淀粉钠和交联聚维酮的崩解作用，并确定外加法为崩解剂的加入方法。最后选择对制剂影响较大的辅料用量、微晶纤维素和淀粉的比例、羧甲基淀粉钠的用量进行三因素五水平的星点设计-效应面法实验的考察，结果显示拟合效果较好，经实验验证确认优化工艺稳定可行，重复性较好。但实验室小试提取、成型工艺关键参数具有局限性，故今后进行中试，以期为痛风片的大规模生产提供重要依据。