杨薇熹，张思奇，向小凤，石 英，段长青，兰义宾

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，葡萄与葡萄酒研究中心，农业农村部葡萄酒加工重点实验室，北京 100083）

挥发性酚在葡萄酒中质量浓度范围在μg/L至mg/L级别，由于容易辨识的香气特征和较低的感官阈值，该类物质极易影响和修饰葡萄酒的风味。较低浓度的挥发性酚常赋予葡萄酒特殊的烟熏、皮革、香料、烘烤等香气，但是在高浓度下表现为令人不愉悦的马厩味、酚味、药味等，破坏葡萄酒香气的协调性。葡萄酒中的挥发性酚可能来源于橡木制品，同时，在未过桶的葡萄酒中也能检测到挥发性酚的存在，这部分挥发性酚来源于葡萄果实。葡萄果实中的挥发性酚主要以游离态和糖苷结合态的形式存在。

由于挥发性酚在葡萄果实和葡萄酒中含量较低，再加上基质较为复杂，常规的检测技术难以实现葡萄果实与葡萄酒中挥发性酚的准确定量。目前，已报道多种挥发性酚的靶向检测方法，其中，由于较高的分离效率和灵敏度，气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用技术在挥发性酚的检测分析中最为常见。近年来发展了基于气相色谱-串联质谱（gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry，GC-QqQ-MS/MS）技术的多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）方法，该方法同时具备较高的分离度和较强的靶向性，非常适用于复杂基质中痕量挥发性组分的定量分析。另外，为了进一步提高检测效果，目前报道了多种挥发性酚的提取和富集方法，包括顶空固相微萃取、搅拌棒吸附萃取、液液萃取、固相萃取（solid phase extraction，SPE）等富集技术，以及乙酸酯化、硅烷化等衍生化方法。其中SPE方法操作简便，可以在富集目标物质的同时除去部分杂质，在多种基质中的应用均表现出较强的有效性和选择性。但是，已报道的SPE法仅针对某几种挥发性酚的提取和检测，并不能完整描绘葡萄酒中挥发性酚的整体轮廓。另外，这些方法仅适用于葡萄酒基质，而葡萄果实中挥发性酚及其糖苷态的检测方法鲜有报道。为了进一步研究葡萄酒中挥发性酚来源、转化关系和演变规律，迫切需要建立葡萄果实中游离态和结合态挥发性酚的富集和定量方法。Allen等用SPE方法分别提取了果实中的游离态和糖苷结合态挥发性酚，采用酸解法对糖苷态挥发性酚进行水解，然后对释放出的挥发性酚进行检测。此外，糖苷态香气物质的水解释放还能采用酶解法，酶解法具备更强的选择性。

基于以上研究现状，本研究采用SPE前处理方法，分别提取游离态和糖苷态挥发性酚，采用酶解法对果实中糖苷态挥发性酚进行水解。基于GC-QqQ-MS/MS联用技术，建立葡萄果实与葡萄酒中挥发性酚的MRM定量方法，并对SPE条件进行优化，以期为葡萄与葡萄酒中挥发性酚的研究提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选用2020年产自新疆玛纳斯的‘赤霞珠’葡萄果实和一款2018年‘赤霞珠’干红葡萄酒进行方法的优化以及准确性、精密度的评价。分别在模拟葡萄酒和模拟葡萄汁体系中考察方法的线性关系。模拟葡萄酒为体积分数10%的乙醇溶液，加入7 g/L酒石酸、4 g/L葡萄糖，用氢氧化钠将溶液pH值调至3.3。模拟葡萄汁为含有160 g/L葡萄糖和7 g/L酒石酸的溶液，用氢氧化钠将溶液pH值调至3.3。方法验证采用10 款商业干红葡萄酒和10个酿酒葡萄果实样品，见表1。

表1 用于方法验证的葡萄酒和葡萄果实样品Table 1 Wine and grape samples used for method validation

苯酚（99.9%）、邻甲基酚（≥99%）、间甲基酚（≥99%）、对甲基酚（≥99%）、4-乙基苯酚（99%）、3-乙基苯酚（≥98%）、4-乙烯基苯酚（95%）、愈创木酚（≥98%）、4-甲基愈创木酚（99%）、4-乙基愈创木酚（≥98%）、4-乙烯基愈创木酚（98%）、4-丙基愈创木酚（≥99%）、丁香酚（98%）、异丁香酚（≥99%）、紫丁香酚（99%）、香草醛（≥98%）、丁香醛（≥98%）、松柏醛（98%）、3,4-二甲基苯酚（98%） 美国Sigma-Aldrich公司；氢氧化钠、葡萄糖、柠檬酸、十二水合磷酸氢二钠（均为分析纯） 北京化工厂；酒石酸（分析纯） 津科精细化工研究所；乙醇、甲醇、二氯甲烷（均为色谱纯） 美国Fisher公司；交联聚乙烯基吡咯烷酮（polyvinylpolypyrrolidone，PVPP）、--葡萄糖酸内酯（均为分析纯） 生工生物工程（上海）股份有限公司；无水硫酸钠（色谱纯，99%） 上海麦克林公司；AR2000糖苷酶 荷兰DSM公司；固相萃取柱Cleanert PEP-SPE（500 mg/6 mL） 天津博纳艾杰尔科技有限公司。

1.2 仪器与设备

BSA223S分析天平（精度0.000 1 g） 德国赛多利斯有限公司；A 11 B S025果实研磨机 德国IKA公司；Micro 17R离心机 美国赛默飞世尔科技有限公司；Fotector Plus高通量全自动固相萃取仪 中国瑞科集团股份有限公司；Intuvo 9000-7010BGC-QqQ-MS/MS联用仪、7693自动进样器 美国安捷伦科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

葡萄果实取汁：参照Lan Yibin等的方法，称取保存于-80 ℃冰箱的葡萄果实50 g，在液氮保护下除去果梗和种子，加入0.5 g-葡萄糖酸内酯和1 g PVPP，用果实研磨机破碎为粉末状；粉末在4 ℃密闭环境下浸渍4 h，然后在4 ℃、8 000 r/min条件下离心10 min，收集上层澄清葡萄汁。

葡萄果实和葡萄酒游离态挥发性酚的提取：采用相同的SPE法分别提取葡萄汁和葡萄酒中的游离态挥发性酚。利用加入标准品的‘赤霞珠’葡萄酒进行SPE方法的优化，各目标化合物的加标质量浓度为。分别对去离子水淋洗体积和二氯甲烷洗脱体积这2个参数进行优化，通过比较不同条件下各目标化合物的峰面积大小评价萃取效率，选择能使各目标化合物出峰面积最大的方法作为最优萃取方案。样品经滤网过滤后，量取10 mL置于50 mL试管中，加入10 μL内标（3,4-二甲基苯酚，0.2 g/L溶解于乙醇）。Cleanert PEP-SPE萃取柱依次经过10 mL二氯甲烷、10 mL甲醇和10 mL去离子水活化后，样品以2 mL/min流速通过萃取柱，用去离子水洗去糖、酸和大分子的极性物质，比较3个去离子水淋洗体积（5、10 mL和15 mL）对萃取效果的影响；游离态挥发性酚用二氯甲烷洗脱，比较了3个洗脱体积（5、10 mL和15 mL）对萃取效果的影响。收集的二氯甲烷洗脱液用1.5 g无水硫酸钠除水后氮吹浓缩至500 μL待测。

葡萄汁中糖苷态挥发性酚的提取：葡萄汁在提取了游离态挥发性酚后，用10 mL甲醇溶液洗脱SPE柱中的糖苷结合态挥发性酚。结合态挥发性酚的酶解参考Allen等方法，收集的甲醇洗脱液在30 ℃真空条件下旋转蒸发后，用10 mL柠檬酸-磷酸缓冲液（0.2 mol/L，pH 5.0）复溶，加入200 μL AR2000溶液（0.1 g/mL，溶于柠檬酸-磷酸缓冲液），转移至密闭离心管中，40 ℃恒温酶解16 h。酶解后的溶液采用游离态挥发性酚的提取方法，提取酶解释放出的挥发性酚。

1.3.2 GC-QqQ-MS/MS分析条件

GC条件：HP-5MS色谱柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；载气为高纯氦气（＞99.999%），流速1.0 mL/min。进样量1 μL，采用4∶1分流进样方式，进样口温度250 ℃。升温程序：起始温度40 ℃，以5 ℃/min升至80 ℃，以2 ℃/min升至120 ℃，以5 ℃/min升至160 ℃，最后以30 ℃/min升至220 ℃，后运行以280 ℃保持1 min。

MS条件：电子电离源；电离能量70 eV；离子源温度230 ℃；辅助加热器温度300 ℃；MS1和MS2四极杆温度均150 ℃。猝灭气为氦气，流速2.25 mL/min；碰撞气为氮气，流速1.5 mL/min。首先采用全扫描模式检测目标化合物，确定各物质保留时间，选择1～2个丰度较高、质荷比（/）较大的碎片离子作为前级离子。采用产物离子扫描模式对目标物质前级离子进行二级质谱扫描，在碎片离子中选择丰度较高的离子作为相对应的产物离子，得到特征离子对（前级离子→产物离子），优化碰撞能量，建立MRM方法。

1.3.3 方法评价

灵敏度和线性关系：用模拟葡萄酒（模拟葡萄汁）配制第1梯度标准品溶液（），各化合物质量浓度见表2。按照2 倍梯度稀释方法分别得到12个梯度的模拟葡萄酒（或模拟葡萄汁）标准溶液。在每个质量浓度梯度中均加入10 μL内标（3,4-二甲基苯酚，0.2 g/L）。各质量浓度梯度标准溶液经过与样品相同的前处理方法和GC-QqQ-MS/MS分析后，用目标化合物和内标峰面积的比值（）与相对应的质量浓度（）绘制标准曲线。将低质量浓度标准溶液继续稀释，直到目标化合物的峰面积比不再成线性降低（代入标准曲线后＜0.99），此时物质质量浓度作为线性范围的最小值。检出限和定量限的计算参考Qian Xu等的方法，以信噪比等于3对应的化合物质量浓度为检出限，信噪比等于10对应的化合物质量浓度为定量限。

准确性和精密度：通过计算在葡萄汁和葡萄酒基质中目标化合物的加标回收率评价方法的准确性。分别用‘赤霞珠’干红葡萄酒和‘赤霞珠’葡萄汁作为基质溶液。在100 mL容量瓶中分别加入混标，用基质溶液定容，得到2种基质下高浓度（H）和低浓度（L）的加标样品（表2）。用1.3.1节和1.3.2节方法对原基质溶液和加标样品进行提取和检测，重复6 次实验，计算加标回收率。

采用低浓度加标样品，考察日内、日间检测的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）以评价方法的精密度。同一日内不同时间提取检测5 次，计算日内RSD，评价日内精密度；连续5 d同一时间进行提取检测，计算日间RSD，评价日间精密度。

表2 挥发性酚类物质CAS编号、感官阈值及方法优化和评价样品的加标质量浓度Table 2 CAS number and sensory threshold of volatile phenols and spiked concentrations used for method optimization and evaluation

1.4 数据统计与分析

GC-QqQ-MS/MS数据分析采用Agilent Quantitative Analysis B.10.00软件进行，目标物质依据标准品保留时间、离子碎片信息结合NIST 11标准谱库比对进行定性分析。定量分析采用内标标准曲线法。单因素方差分析（Duncan，＜0.05）采用SPSS 20.0软件进行。

2 结果与分析

2.1 方法优化

2.1.1 仪器参数优化

表3列出优化后MRM方法中目标化合物的保留时间、特征离子对和碰撞能量等信息。用该方法检测加标的葡萄酒样品，可以检测到20个目标物质峰（其中异丁香酚存在顺反异构）和1个内标峰，目标物质所选特征离子对的扫描不受样品中其他物质干扰，物质分离度较高、峰形良好（图1）。

表3 挥发性酚检测质谱参数Table 3 Mass spectrometric parameters for determination of volatile phenols

续表3

图1 加标葡萄酒样品中目标物质MRM色谱图Fig. 1 MRM chromatogram of target compounds spiked in wine samples

2.1.2 淋洗体积优化

图2 去离子水淋洗体积对目标化合物响应的影响Fig. 2 Effect of washing with different volumes of deionized water on the response for target analytes

在二氯甲烷洗脱体积为10 mL条件下，采用3种不同体积（5、10 mL和15 mL）去离子水淋洗萃取柱，比较目标化合物的出峰面积以评价不同体积去离子水淋洗后的萃取效果。与5 mL去离子水淋洗体积相比，采用10 mL去离子水淋洗后4-乙基愈创木酚、松柏醛和异丁香酚的响应显著降低；采用15 mL去离子水淋洗后间甲基酚、4-丙基愈创木酚的响应显著降低（图2）。去离子水淋洗可以减少糖类和有机酸类物质，除去体系中的亲水性杂质，但同时也可能溶解带走部分目标化合物，使其检测响应降低。此外，其他目标化合物的响应在不同淋洗体积下没有表现出显著差异（图2）。综合考虑各目标化合物的萃取效果，选择5 mL去离子水用量作为最佳淋洗体积。

2.1.3 洗脱体积优化

在去离子水淋洗体积为5 mL的条件下，采用3种体积（5、10 mL和15 mL）二氯甲烷进行洗脱，比较目标化合物的出峰响应，以评价不同洗脱体积对萃取效果的影响。甲基酚类、乙基苯酚、4-乙烯基愈创木酚和丁香酚的响应在不同洗脱体积下无显著差异。采用5 mL二氯甲烷洗脱，苯酚和4-乙烯基苯酚的响应显著低于10 mL和15 mL的洗脱体积（图3）。洗脱体积较少时可能存在物质洗脱不完全的情况，导致萃取到的目标化合物较少。各目标化合物在10 mL和15 mL二氯甲烷洗脱后的响应没有显著差异。综合考虑各目标化合物的萃取效果，选择10 mL二氯甲烷用量作为最佳洗脱体积。

图3 二氯甲烷洗脱体积对目标化合物响应的影响Fig. 3 Effect of elution with different volumes of dichloromethane on the response for target analytes

2.2 方法评价

在优化后的前处理方法和仪器检测条件下，对该方法的检出限、定量限、线性关系、准确性和精密度进行评价。

2.2.1 线性范围、检出限及定量限

在模拟葡萄酒和模拟葡萄汁中，19种目标物质的检出限和定量限范围分别为0.02～1.01 μg/L和0.08～3.36 μg/L，其中有11种物质定量限均小于1 μg/L，具有较高灵敏度。本方法中挥发性酚的检出限和定量限比前人报道的液液萃取以及搅拌棒吸附萃取法更低或相近，远低于化合物的感官阈值（表2）。此外发现，4-乙基苯酚和4-乙基愈创木酚的检出限和定量限均低于其相应的乙烯基酚形式（表4），本方法对乙基酚类物质的检测灵敏度比乙烯基酚类更高，该现象与前人报道相符。

如表4所示，各目标化合物在检测范围内线性关系较强，回归系数（）均大于0.99。相同质量浓度梯度标准液在模拟葡萄汁和模拟葡萄酒中进行检测，结果显示，愈创木酚、4-乙基苯酚、3-乙基苯酚和4-丙基愈创木酚等物质线性方程的斜率在2种基质中有较大差异，这些物质在模拟葡萄酒中检测比在模拟葡萄汁中检测所得线性方程的斜率更大。说明这些化合物的检测容易受到基质（乙醇和葡萄糖浓度）的影响，在实际样品检测时，应使用相应基质中测得的标准曲线进行计算。

表4 挥发性酚检测线性范围、检出限和定量限Table 4 Linear ranges, limits of detection and limits of quantification of volatile phenols

2.2.2 准确性评价

19种物质在葡萄汁和葡萄酒基质中的加标回收率分别为81.99%～122.72%和82.59%～112.64%（表5）。除了香草酸在葡萄汁基质中的加标回收率为122.72%以外，其他物质的加标回收率都在80%～120%范围内，方法准确性较高。

表5 挥发性酚检测重复性、重现性及加标回收率Table 5 Repeatability, reproducibility and spiked recoveries for the detection of volatile phenols%

续表5 %

2.2.3 精密度评价

该方法下，各目标化合物日内RSD小于8.26%，日间RSD小于13.25%（表5），该方法重复性良好。

Sousa等利用乙酸酐衍生结合液液萃取的方法对葡萄酒中的挥发性酚进行检测，方法的检出限为1.5～3.9 μg/L，加标回收率为67%～126%；Allen等报道了利用硅烷衍生结合SPE方法检测葡萄果实和葡萄酒中的23种挥发性酚，方法检出限为2.5～25 μg/L，加标回收率平均为73.9%～114.5%，变异系数为10.3%～21.3%；本方法的检出限为0.02～1.01 μg/L（表4），加标回收率为81.99%～122.72%范围，日内、日间RSD均小于15%（表5），本方法的准确性较高，稳定性较强。

2.3 葡萄与葡萄酒中挥发性酚分析

为验证该方法的普遍适用性，对10个葡萄果实样品及10 款干红葡萄酒的挥发性酚进行测定。20个样品中均能检出19种挥发性酚，其含量在检测方法的线性范围内（表2、6）。

检测到葡萄果实中香草酸含量均值最高，其游离态和结合态总量为36.04～865.75 μg/L（图4）。检测到葡萄酒样品中，4-乙基苯酚、3-乙基苯酚及4-乙烯基苯酚是干红葡萄酒中含量均值最高的3种目标物，其质量浓度范围较广，分别为2.43～6 379.99、5.39～3 786.69 μg/L和32.06～869.09 μg/L，样品间含量差异较大。检测到一些干红葡萄酒样品中，4-乙基苯酚、4-乙烯基苯酚、3-乙基苯酚、4-乙基愈创木酚和4-乙烯基愈创木酚含量远高于葡萄果实中游离态和结合态总和（表4），说明这些物质有除糖苷态以外的其他前体来源。有研究表明，乙基酚类和乙烯基酚类物质可能来源于发酵过程中微生物代谢羟基肉桂酸产生，且该反应受到前体物含量、微生物类型、发酵工艺和陈酿条件等因素的影响。由于受到多种因素的影响，在葡萄酒酿造和陈酿过程中可能不同程度地生成了这些物质，所以这类挥发性酚在干红葡萄酒中的含量范围通常较广（表4），本研究建立方法具备较广线性范围，在所需检测范围内大于0.99，线性较好，可以满足检测要求。

表6 10个葡萄果实样品与10 款葡萄酒中挥发性酚质量浓度Table 6 Concentrations of volatile phenols in 10 grape samples and 10 wine samples μg/L

图4 葡萄果实（A）与葡萄酒（B）中挥发性酚的含量分布Fig. 4 Distribution of volatile phenols in grape berry (A) and wine (B) samples

3 结 论

针对葡萄与葡萄酒中挥发性酚的检测建立基于GCQqQ-MS/MS的MRM方法，采用SPE前处理方法结合糖苷酶酶解法，能够同时满足葡萄汁和葡萄酒中19种挥发性酚的定量分析。该方法分别在葡萄汁和葡萄酒2种基质中进行验证，结果表明该方法具有较高灵敏度（检出限和定量限范围分别为0.02～1.01 μg/L和0.08～3.36 μg/L）；在检测所需含量范围内具备良好的线性关系（＞0.99）；加标回收率为81.99%～122.72%，日间、日内RSD不高于13.25%，方法具备较高的准确度和精密度。