吴彬彬，傅采琪，胥 伟，郭丹郡,*，贺文杰，易 阳，王宏勋

（1.武汉轻工大学食品科学与工程学院，农产品加工教育部重点实验室，湖北 武汉 430023；2.武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北省农产品加工与转化重点实验室，湖北 武汉 430023）

肉及肉制品的色泽变化受很多因素影响，例如肉的来源、肉品的加工、运输和贮存条件，但其根本影响因素是肉中肌红蛋白的变化。肌红蛋白有3种存在形式：脱氧肌红蛋白、氧合肌红蛋白（oxymyoglobin，OMb）、高铁肌红蛋白（metmyoglobin，MMb），而这3种肌红蛋白比例的变化会改变肉的呈色。大部分肉制品在食用前都需要经过高温加工，热处理会改变肉蛋白的结构与理化特性，进而对肉品质产生影响。肌红蛋白作为主要的肌浆蛋白，在热处理过程中发生变性，引起肉色严重劣变的同时还会影响其对消化酶的敏感性，降低肉的营养价值，最终对熟肉产品的保藏与销售产生不良影响。

卤制品在我国历史悠久，因其风味独特、加工品种繁多，占有广阔市场。卤鸭是中国卤肉制品的代表，八角作为主要卤制香辛料，具有抑菌、抗氧化等功效。国内外研究发现，香辛料主效成分对卤肉重要品质——色泽有一定程度影响。Armida、Carolina及Akarpat等发现香辛料主效成分能通过抑制OMb自动氧化生成MMb，进而改善肉制品色泽。邢淑婕等将茶多酚添加至鸡腿肉中，发现贮藏过程中茶多酚通过抑制鸡肉中丙二醛生成以及增强总抗氧化能力，降低肌红蛋白氧化程度，改善卤鸡腿色泽。而关于热处理过程中八角莽草酸对鸭腿色泽影响的研究鲜见报道。因此，本实验探究八角提取液对鸭腿色泽的影响，并初步探讨热处理过程中八角主效成分莽草酸与肌红蛋白在不同质量比下对卤鸭腿色泽的影响机制，以期为热处理过程中香辛料对肉品质影响机制等相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冻鸭腿 正大蛋业有限公司；牛血清蛋白（纯度≥98%） 德国BioFroxx有限公司；乙醇、乙酸乙酯、Tris、甘氨酸、考马斯亮蓝、氯化镁、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、氯化钠、氯化钾、乙二酸四乙酸二钠、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonylfluoride，PMSF）、-巯基乙醇（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

F-7000型荧光分光光度计、N-500近红外光谱仪日本日立公司；Evolation 300型紫外-可见分光光度计美国Thermo Fisher Scientific公司；TGL16M冷冻离心机上海安亭科学仪器厂；FA2004B分析天平 奥豪斯仪器公司；TG16WS超速离心机 湖南长沙平凡仪器仪表有限公司；HH-2恒温水浴锅 金坛区白塔新宝仪器厂；UVS-1旋涡振荡器 常州国华电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鸭腿肌红蛋白制备

参考马兰等的方法并略有改进。取5 g肉样，切碎，加入50 mL缓冲液（3.5 mmol/L MgCl、4 mmol/L EDTA、70 mmol/L Tris，pH 7.4），1 000 r/min匀浆30 s后，4 ℃、5 000 r/min离心15 min，过滤上清液，即得肌红蛋白粗提液。

1.3.2 莽草酸的制备与测定

参考程琦等的方法并略有改进。称取50 g经干燥粉碎的八角粉末于1 000 mL烧杯中，加入600 mL体积分数60%乙醇溶液（食用级），60 ℃超声提取2 h后，取出静置10 min，减压过滤，50 ℃旋转蒸发浓缩定容至500 mL容量瓶中，得香辛料提取液，再经冻干得到莽草酸提取物。

莽草酸检测色谱条件：Agilient-ZOBAX C色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温30 ℃；检测波长210 nm；流速1.0 mL/min，进样量20 μL；流动相A为乙腈，流动相B为体积分数0.5%磷酸溶液。

根据莽草酸标准曲线测定八角中莽草酸含量，莽草酸线性方程为=13 144.16-0.68，=0.999 9。本研究选取的八角莽草酸含量为0.114 1 mg/g。

1.3.3 色差测定

参照杨宁宁等和贺文杰的方法并略有改变。将八角提取液按液料比1∶25（mL/g）加入鸭腿中，鸭腿卤制过程中每10 min进行取样，并采用已校准的色差计测定鸭腿亮度值（*）、红度值（*）和黄度值（*），*和*/*能客观展示卤鸭腿的颜色变化以及整体品质。每个样品表面随机测定6个点后取平均值。

1.3.4 MMb及OMb相对含量测定

参考Liu Fang等的方法并略有改动。据八角提取液添加时间点、添加量以及该时间点对应肌红蛋白含量，制备莽草酸与肌红蛋白质量比分别为1∶10 000、1∶5 000、1∶2 500、1∶1 250的混合溶液，90 ℃水浴30 min，每水浴10 min分别取2 mL混合溶液以及空白组样液，并测定其在525、545、565、572 nm波长处吸光度。以不添加莽草酸的肌红蛋白溶液为空白组样液。OMb及MMb相对含量分别按式（1）、（2）计算：

式中：、、分别为/、/、/。

1.3.5 分子荧光光谱测定

参考Turgut等的方法并略有改动。根据八角提取液添加时间点、提取液与鸭肉比例以及该时间点对应肌红蛋白含量，制备莽草酸与肌红蛋白质量比分别为1∶10 000、1∶5 000、1∶2 500、1∶1 250的混合溶液，90 ℃水浴30 min，每水浴10 min分别取2 mL混合溶液以及空白组样液进行荧光扫描，以不添加莽草酸的肌红蛋白溶液为空白组样液。荧光扫描条件：固定激发波长296 nm，发射波长270～350 nm，激发、发射狭缝宽度均为2.5 nm，扫描速率12 000 nm/min。

1.3.6 热重分析

参考Kocher等的方法并略有改动。制备莽草酸与肌红蛋白质量比分别为1∶10 000、1∶5 000、1∶2 500、1∶1 250的混合溶液，90 ℃水浴15 min，分别对各组样液进行热重分析，升温范围20～120 ℃，升温速率10 ℃/min。

1.3.7 粒径测定

参考卢岩等的方法并略有修改。将莽草酸与肌红蛋白质量分别按照1∶10 000、1∶5 000、1∶2 500、1∶1 250的比例混合，取混合样液1.5 mL，10 000 r/min离心10 min，粒径仪测定温度25℃。

1.3.8 傅里叶变换红外光谱分析

参考Nguyen等的方法并略有改动。制备莽草酸与肌红蛋白质量比分别为1∶10 000、1∶5 000、1∶2 500、1∶1 250的混合溶液，90 ℃水浴30 min，每水浴10 min取2 mL混合溶液进行红外光谱分析，以不添加莽草酸的肌红蛋白溶液为空白组样液。红外光谱测定参数：扫描范围500～4 500 cm，信号采集模式为衰减全反射模式。

2 结果与分析

2.1 热处理中八角提取液对卤鸭腿色泽的影响

图1 添加八角提取液对卤鸭腿色泽的影响Fig. 1 Effect of anise extract on color of braised duck thigh

肉制品色泽是判断其感官品质的最直观指标，*和*/*共同反映卤制品的色泽情况。由图1可知，随着卤制时间延长，添加八角提取液的卤鸭腿*、*均呈不同程度下降趋势，说明高温使鸭腿成熟度增大，导致鸭腿红度及白度降低。*则随着卤制时间延长呈上升趋势，说明在高温条件下，八角主效成分逐渐迁移至鸭肉中，鸭腿黄度会逐渐增大。当卤制40 min时，添加八角提取液的卤鸭腿*为5.00、*/*为0.34，均高于未添加提取液组（*为3.50、*/*为0.23），说明相较于空白组，八角提取液能一定程度抑制高温对肉制品中呈色物质（肌红蛋白）的氧化劣变，进而维持卤鸭腿红度。

2.2 莽草酸与肌红蛋白结合机制

图2 肌红蛋白与莽草酸结合的Benesi-Hildebrand图Fig. 2 Benesi-Hildebrand plot for the combination of myoglobin and star aniseed shikimic acid

热处理过程中莽草酸与肌红蛋白结合机制是两者质量比的选择依据。由图2可知，热处理过程中，莽草酸与肌红蛋白质量比为1∶10 000、1∶5 000、1∶2 500、1∶1 250的混合溶液的1/（莽草酸质量浓度）与相对应的Δ/Δ均满足Benesi-Hildebrand方程Δ/Δ=1+1/。上述结果说明热处理过程中，肌红蛋白与莽草酸能发生反应，且在该质量比条件下满足动态结合机制。因此，本实验选取莽草酸与肌红纤维蛋白质量比为1∶10 000、1∶5 000、1∶2 500、1∶1 250，进行后续研究。

2.3 莽草酸对卤鸭腿中OMb及MMb相对含量的影响

由图3可知，与初始值相比，热处理10、20、30 min时空白组OMb相对含量分别减少了0.31%、0.79%、11.26%，同时MMb相对含量分别增加了7.34%、3.34%、34.51%，说明高温条件下，OMb中亚铁离子会被逐渐氧化形成铁离子，进而转变成MMb，这也是肉制品色泽发生劣变的原因。然而，相同热处理时间下，随着莽草酸与肌红蛋白质量比增加，OMb相对含量呈先下降后上升趋势，MMb相对含量呈先上升后下降趋势。因此，莽草酸可能通过抑制OMb中铁卟啉环中亚铁离子氧化为铁离子进而抑制MMb生成，最终改善卤鸭腿色泽。但是莽草酸含量过高可能会影响肌红蛋白中的键合作用，进而使铁卟啉环中亚铁离子暴露在外部极性环境中。这与Van Ba等发现温度对肌红蛋白状态影响的结果相似。

图3 热处理时莽草酸对OMb（A）和MMb（B）相对含量的影响Fig. 3 Effect of shikimic acid on relative contents of OMb (A) and MMb (B) during heat treatment

2.4 莽草酸对肌红蛋白热变性的影响

表1 莽草酸对肌红蛋白变性温度和热吸收的影响Table 1 Effect of shikimic acid from star aniseed on the denaturation temperature and heat absorption capacity of myoglobin

由表1可知，随着莽草酸与肌红蛋白比例增大，肌红蛋白的变性温度、初始变性温度呈先下降后上升趋势，热吸收量呈先上升后下降趋势。当莽草酸与肌红蛋白质量比为1∶10 000时，肌红蛋白变性温度及初始变性温度最高（92.35、117.68 ℃）、热吸收量最低（628.42 g/J）。说明莽草酸可能通过降低肌红蛋白热吸收量以及抑制铁卟啉环断裂进而避免亚铁离子进入极性环境中与活性氧结合形成铁离子，但莽草酸含量过高可能会导致蛋白中化学键受到破坏，进而更容易发生断裂。

2.5 莽草酸对肌红蛋白内源荧光强度的影响

图4 热处理时莽草酸对肌红蛋白内源荧光强度的影响Fig. 4 Effect of shikimic acid on endogenous fluorescence intensity of myoglobin during heat treatment

分子荧光光谱法监测热处理过程中肌红蛋白内部色氨酸、酪氨酸降解情况以及铁卟啉环结构变化，这些变化均是肌红蛋白热变性重要特征。肌红蛋白中主要荧光物质为色氨酸和酪氨酸残基以及血红素铁卟啉的Soret带，选取296 nm作为固定激发波长，在此波长下可认为肌红蛋白中内源荧光来自色氨酸残基以及血红素铁卟啉环。如图4所示，当热处理30 min时，相较于空白组，肌红蛋白在发射波长296 nm处的荧光强度均明显增大。这说明莽草酸通过与肌红蛋白铁卟啉环以及色氨酸充分结合，避免铁卟啉环、色氨酸遭到活性自由基破坏，从而防止鸭腿色泽劣变。

2.6 热处理过程中莽草酸对肌红蛋白粒径的影响

图5 热处理时莽草酸对肌红蛋白粒径的影响Fig. 5 Effect of shikimic acid on myoglobin particle size during heat treatment

肌红蛋白粒径可以较直观反映卤制过程中肌红蛋白交联程度进而解释高温条件下香辛料提取物对肌红蛋白热变性影响。由图5可知，当莽草与肌红蛋白质量比为1∶5 000、热处理30 min时，肌红蛋白粒径由空白组的756 nm减小为183 nm，说明莽草酸可明显抑制蛋白质聚集进而增加蛋白质粒度分布从而维持蛋白质的稳定性，并最终使卤鸭腿色泽达到较佳水平。这与Ince-Coskun等发现盐离子以及高温对乳清蛋白粒径影响的结果相符。

2.7 莽草酸对肌红蛋白二级结构的影响

表2 莽草酸对肌红蛋白二级结构相对含量的影响Table 2 Effect of shikimic acid on the secondary structure of myoglobin%

由表2可知，热处理30 min时，相较于空白组，莽草酸与肌红蛋白质量比为1∶10 000的肌红蛋白-螺旋相对含量增加了14.55%，无规卷曲相对含量最低（31.62%），远低于空白组（46.61%）。由此可知，莽草酸能一定程度阻止热处理中蛋白质-螺旋结构转变为-折叠，进而转变为-转角和无规卷曲结构，从而维持蛋白整体结构稳定。因此，此时卤鸭腿色泽达到最佳。此结果与Chen Cheng等利用近红外光谱分析所得热处理中肌红蛋白二级结构变化情况相似。

3 结 论

研究八角提取液对卤鸭腿色泽的影响，并集中于莽草酸对肌红蛋白结构的影响以及相关机理进行探究，结果表明，八角提取液能较好地抑制高温对鸭肉中呈色物质（肌红蛋白）的氧化劣变，进而维持卤鸭腿的红度。八角主效成分莽草酸能有效抑制OMb转变为MMb，当莽草酸与肌红蛋白质量比为1∶10 000、热处理30 min时，莽草酸可降低肌红蛋白热吸收量，并与色氨酸结合进而防止蛋白质内部结构降解，进一步探究发现莽草酸可明显抑制蛋白质聚集进而增强蛋白质粒度分布，并较好地保持蛋白二级结构稳定性，从而维持肌红蛋白整体结构的稳定，最终有效改善鸭腿色泽。此结果可在为热处理中香辛料对肉制品品质影响机制等相关研究提供参考。