张建国，何亮，王久阳，姜涛

(北京市平谷区医院 1.普外科,2.病理科, 北京 101200)

肝癌在人类恶性肿瘤中发病率排名第六，是全球第四大肿瘤相关死亡原因[1]。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC) 是最常见的原发性肝癌类型，与多种众所周知的病因相关，包括慢性 HBV 或 HCV 感染、酗酒、非酒精性脂肪肝以及接触黄曲霉毒素等膳食毒素[2]。HCC 是一种高度异质性疾病，发病机制复杂。尽管手术切除、肝移植、经皮消融、靶向治疗和放疗已被用作HCC临床治疗方法，但由于治疗后复发率和转移率高，HCC患者的预后仍不理想[3]。因此，需要探索新型药物靶点和预后生物标志物，为 HCC 患者提供使其获得更有效的个性化治疗和更好的预后。

1 材料与方法

1.1 癌症基因组图谱(the cancer genome atlas, TCGA)数据库

TCGA(https:∥portal.gdc.cancer.gov/)是由美国国家癌症研究所和国家人类基因组研究所公共资助的项目，该项目通过大规模高通量测序分析技术创建全面的癌症基因组图谱[8]。本研究从该数据库中获取了50例正常组织及374例HCC组织的mRNA数据(FPKM)和HCC患者的临床信息(表1)。

表1 TCGA数据库中HCC患者的临床病理特征Tab 1 Characteristics of HCC patients in the TCGA database

1.2 基因表达谱交互式分析(gene expression profiling interactive analysis，GEPIA)和Kapla Meier数据库

1.3 UALCAN和cBioPortal数据库

UALCAN数据库是一个公开可用的门户网站(http:∥ualcan.path.uab.edu)，它提供对来自TCGA数据的在线分析[11]。cBioPortal数据库(http:∥cbioportal.org) 是一个可以公开获取的数据资源平台，旨在为癌症基因组学数据集提供可视化和分析，包括甲基化、拷贝数变异和突变[12]。本研究首先使用UALCAN数据库分析NEIL3启动子区域甲基化程度在正常组织和HCC组织之间的差异。然后通过cBioPortal数据库分析HCC组织中NEIL3表达与甲基化水平的相关性。

1.4 蛋白互作网络的构建和功能探索

1.5 共表达基因的获取和富集分析

LinkedOmics(http:∥www.linkedomics.orglogin.php) 是软件生态系统中一种新的独特工具，用于分析来自大规模癌症组学项目的数据[15]。本研究使用LinkedOmics的LinkFinder模块探索NEIL3的共表达基因；然后使用LinkInterpreter模块进行GSEA分析探索NEIL3及其相关基因可能参与的信号通路，FDR值<0.05通路有显著意义。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 NEIL3在HCC中显著高表达

来自于TCGA数据库的mRNA数据分析显示，与正常癌旁组织相比，NEIL3在HCC组织中显著上调(P<0.001)(图1A)。另外，来自TCGA数据库的配对样本进一步分析显示，与配对癌旁组织相比，NEIL3在肝细胞癌组织中也显著高表达(P<0.001)(图1B)。

A．与正常癌旁组织相比，NEIL3在HCC组织中显著高表达；B. 与配对癌旁组织相比，NEIL3在HCC组织中显著高表达图1 NEIL3在肝脏癌旁组织和HCC组织中的表达差异A. NEIL3 was significantly highly expressed in HCC tissues compared to normal paraneoplastic tissues; B. NEIL3 was significantly highly expressed in HCC tissues compared to paired paraneoplastic tissuesFig 1 Differences in NEIL3 expression in paraneoplastic liver tissues and HCC tissues

2.2 NEIL3表达在HCC患者临床病理特征中的差异

根据NEIL3中的中位表达值将HCC患者分为高、低NEIL3表达组。对高、低NEIL3表达组患者临床特征的差异比较显示，NEIL3表达在患者的病理分期中存在差异(表2)。

表2 NEIL3表达与HCC患者临床病理性状的关系 例Tab 2 Relationship between NEIL3 expression and clinicopathological symptoms in HCC patients cases

2.3 NEIL3表达在HCC预后中的价值

B． 高NEIL3表达组患者的OS和DFS较低表达组患者差(GEPIA数据库)； F.高NEIL3表达组患者的OS、DFS、PFS和RFS较低表达组患者差(Kapla Meier数据库)图2 NEIL3在HCC预后中的价值 B. The overall survival and disease- free survival of patients in the high NEIL3 expression group were poorer than those in the low expression group(GEPIA database); F. Overall survival, disease- free survival, progression- free survival and recurrence- free survival of patients in the high NEIL3 expression group were poorer than those in the low expression group(Kaplan- Meier database)Fig 2 Prognostic value of NEIL3 in hepatocellular carcinoma

2.4 NEIL3在HCC中的甲基化分析

通过UALCAN数据库分析显示，NEIL3启动子区域甲基化程度在HCC组织中显著降低(图3A)。其次，通过cBioPortal数据库分析显示，在HCC组织中随着甲基化水平降低，NEIL3表达越低(图3B)。

A. 与正常组织相比，NEIL3基因启动子区域甲基化程度在HCC中显著降低；B. NEIL3表达与基因甲基化程度呈负相关图3 NEIL3在HCC中的甲基化分析A. The degree of methylation in the promoter region of NEIL3 gene was significantly reduced in HCC compared with normal tissues; B. NEIL3 expression was negatively correlated with the degree of gene methylationFig 3 Methylation analysis of NEIL3 in HCC

2.5 NEIL3蛋白互作网络的构建和功能探索

通过STRING数据库，构建了NEIL3的蛋白互作网络(图4A)，获得了10个与NEIL3存在相互联系的基因(APEX2、DLGAP5、EXO1、FEN1、MUTYH、NCAPG、NEIL1、NTHL1、OGG1和TOP2A)。将这些基因输入到Metascape数据库中进行功能探索，结果如图4B所示。NEIL与其相互作用基因主要参与碱基切除修复、核酸磷酸二酯键水解和姐妹染色体分离等生物学过程和信号通路。

A. NEIL3蛋白互作网络的构建；B. NEIL3及其相互作用网络蛋白的功能分析图4 蛋白互作网络的构建和功能分析A. Construction of NEIL3 protein interaction network; B. Functional analysis of NEIL3 and its interacting network proteinsFig 4 Construction and functional analysis of protein interaction network

2.6 NEIL3共表达基因的获取和通路分析

A.共表达基因火山图；B- C.与NEIL3存在正、负相关的前50个基因；D.NEIL3及其共表达基因的京都基因与基因组百科全书图5 NEIL3在HCC中的共表达分析和功能富集分析A. Volcano map of co- expressed genes; B- C. Top 50 genes positively and negatively associated with NEIL3; D. Kyoto gene and genome encyclopedia of NEIL3 and its co- expressed genesFig 5 C expression analysis and functional enrichment analysis of NEIL3 in HCC

3 讨 论

HCC是最常见的实体恶性肿瘤之一，是全球癌症相关死亡的主要原因[1]。HCC的发生是一个复杂的过程，涉及多种危险因素。HCC在全球的分布随危险因素的流行程度而变化。慢性乙型肝炎病毒(HBV) 感染和黄曲霉毒素 B1(AFB1)吸入是中国和印度等发展中地区的主要危险因素。在发达地区，HCC主要由丙型肝炎病毒(HCV)和非酒精性脂肪肝引起的肝硬化发展而来[2]。目前早期HCC患者多采用肝移植(LT)等根治性疗法。对于中度HCC，主要是局部治疗，如经动脉化疗栓塞(TACE)。对于晚期HCC患者，目前全身药物治疗最为有效。尽管有多种疗法可用于 HCC，但患者的OS仍远不能令人满意，对更有效疗法的需求仍未得到满足[16]。靶向药物是HCC最有前景的治疗选择之一。探索新型预后生物标志物和治疗靶点对改善HCC患者预后具有重大意义。

首先，本研究发现与正常肝脏组织相比，NEIL3在HCC中显著高表达。其次，临床病理相关性分析显示，随着NEIL3的升高，HCC的病理分期和T分期越高。然后生存分析显示高表达NEIL3与HCC患者较差的OS、DFS、PFS和RFS显著相关。这些研究表明，NEIL3可能在HCC中充当癌基因的角色。表观遗传学研究结果表明，NEIL3低甲基化水平可能是NEIL3在HCC中高表达的原因。最后，为了探索NEIL3在HCC中的潜在作用机制，分析NEIL3的互作网络蛋白和相关基因，然后对这些基因进行功能富集分析。有趣的是，这些基因富集在经典的肿瘤信号通路，例如细胞周期、DNA复制、同源重组、错配修复、p53信号通路、碱基切除修复、剪接体和乙型肝炎相关等信号通路。这些信号通路被证实在癌症中具有关键的调节作用。例如细胞周期调控的紊乱是癌症最重要的特征之一[17]。DNA 复制是基本的生物学过程之一，其中失调会导致基因组不稳定。这种不稳定性是癌症的标志之一，并在肿瘤发生过程中赋予遗传多样性[18]。同源重组是哺乳动物细胞中 DNA 双链断裂修复的主要途径，其定义步骤是由 RAD51 蛋白指导的同源链交换，研究显示同源重组缺陷将导致发育异常和增强癌症易感性[19]。DNA 错配修复切除碱基错配以提高 DNA 复制的保真度，而错配修复的丧失导致自发突变增加。结合以上研究结果和相关文献报道，推测NEIL3可能通过这些肿瘤信号通路参与HCC的进程。

综上所述，NEIL3具有作为HCC预后生物标志物和治疗靶点的潜力。NEIL3潜在调控信号通路是理解HCC发病机制的突破点。然而，本研究存在着不可忽视的局限性:缺乏HCC中NEIL3蛋白水平的证据；NEIL3影响HCC患者预后的确切机制尚未完全阐明。应进行进一步的基础实验以验证本研究的结论。