张皓淳

(辽宁省农业发展服务中心，辽宁 沈阳 110034)

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是因为非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)所导致的家猪、野猪等相关动物品种所产生的一类热性、高度接触性的出血性传染病，临床主要以高热、淋巴结及脏器严重出血作为特征，具有较高的接触传染性，不同品种和年龄段的猪均可感染，发病率和死亡率较高，感染ASFV强毒株后致死率可高达100%[1]。ASFV首次在非洲肯尼亚地区发现，2007年扩散到亚美尼亚等地，随后在北欧各国相继发生[2]。我国首例病例于2018年10月发生在辽宁省沈阳市沈北新区，之后在国内各地区广泛暴发和流行，严重影响了我国的养猪业，目前已被农业农村部列为一类动物疫病[3]。现阶段市场上流行的ASF疫苗尚未经过政府相关部门的认可，且保护率还有待提高，因此对ASF的疫病防控应及时采取早期预防、及时扑杀和阻断传播等有效方式[4]。所以，确立灵敏度高的测定手段是该病的重要预防和控制方案之一。作为非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属唯一的病毒种类，ASFV的直径为175 nm～215 nm，是一种二十面体带囊膜的双链DNA病毒。该病毒的遗传物质大小介于170 kb～190 kb，其中含有151个开放阅读框，遗传物质可以编码150～200个蛋白[5-7]。本研究通过构建重组原核质粒pGEX-6P-1-p54，进行原核表达，优化表达条件，确立测定ASFV抗体的间接ELISA方法，为深入探究ASFV测定试剂盒打下夯实的基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

限制性内切酶均购自中国大连宝生物试剂有限公司，GST标签蛋白纯化试剂盒购自美国Clontech公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自美国Sigma公司，GSH-琼脂糖凝胶预装柱购自生工生物工程(上海)股份有限公司，HRP标记的山羊抗猪IgG、山羊抗兔IgG均购自英国Abcam公司，pGEX-6P-1原核表达载体由锦州医科大学实验动物中心提供和保存，ASFV-p54基因质粒、非洲猪瘟阴性和阳性血清、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪口蹄疫病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒阳性血清均由国家外来动物疫病研究中心提供和保存。

1.2 引物的设计与合成

根据GenBank(序列号：NC_044943.1)公布的ASFVp54的基因序列设计1对特异性引物，上游引物p54-F序列：5´-CATATGATGGAT TCTGAATTTTTTCA-3´，下游引物p54-R序列：5´-AAGCTTTTACAAGGAGTTTTCTAGGT-3´，扩 增片段大小为552 bp。为了方便构建质粒，给引物添加相应的酶切位点(BamHI，XhoI)，引物由上海生工合成。

1.3 ASFV-p54重组质粒的构建

以ASFV-p54基因质粒为模板进行PCR扩增。PCR扩增产物使用1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。目的片段用DNA凝胶回收与纯化试剂盒(TaKaRa)进行回收纯化。将回收纯化的目的基因片段与相同酶切位点酶切回收的pGEX-6P-1载体在16 ℃下连接过夜，连接产物转化DH5α感受态细胞，涂于LB琼脂平板上(含80 µg/mL氨苄西林)，37 ℃下恒温过夜培养。次日，选择长势状态良好的单个菌落，将其接种到5 mL的LB液体培养基中(该培养基含有浓度为80 µg/mL的氨苄西林)，37 ℃ 170 r/min培养至对数生长期，菌液PCR和双酶切鉴定正确后，送去测序。PCR反应体系如下(25 µL)：ddH2O 19.75 µL，10×PCR Buffer 2.5 µL，dNTP Mixture(10 mmol/L)1.0 µL，引物(10 µmol/L) 0.5 µL，ExTaq 0.25 µL，cDNA 1.0 µL。其相关条件参数设置为：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，30个循环，72 ℃ 10 min。

1.4 重组质粒的诱导表达

将连接产物pGEX-6P-1均匀涂于LB琼脂平板上(含80 µg/mL氨苄西林)，37 ℃过夜培养。次日，选取长势状态良好的单个菌落，将其接种到5 mL的LB液体培养基(含100 µg/mL氨苄西林)中，37 ℃，200 r/min至OD600nm为0.5时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)诱导表达，之后继续振摇培养数小时后收菌(初步诱导表达条件为：IPTG至终浓度 1.0 mmol/L、30 ℃、220 r/min震荡6 h后收菌[7])。

1.5 诱导表达条件的优化

将目的蛋白诱导的三个重要条件进行优化，将温度(20 ℃、24 ℃、28 ℃、30 ℃、35 ℃)、IPTG终浓度(0、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L、2.0 mmol/L)、诱导时间(0、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h)设置梯度，聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gellectrohoresis，SDSPAGE)分析，通过灰度扫描，最终确定诱导表达的最佳条件。

1.6 重组蛋白的收集纯化

收集诱导后的菌液，5 000 r/min下离心20 min，弃尽上清，依据菌液沉淀量加入适量磷酸缓冲液。经超声波破碎(一次超声10 s，间歇10 s，直至溶液澄清)后，放入低温超速离心机中离心，12 000 r/min，4 ℃，30 min，收集上清液于4 ℃下保存。使用还原性谷胱甘肽琼脂糖凝胶预装柱对收集的上清液进行蛋白纯化，用BCA法测定蛋白含量。

1.7 SDS-PAGE与免疫印迹检测

将纯化蛋白进行SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝染色后观察分析，同时将重组蛋白转移到PVDF膜上，4 ℃过夜封闭，使用ASFV阳性血清为一抗，HRP标记的兔抗猪IgG与山羊抗兔IgG为二抗分别进行杂交1 h，最后ECL显色。

1.8 建立间接ELISA方法

1.8.1 确定重组蛋白最佳包被浓度和血清最佳稀释倍数

使用方阵滴定试验明确最好的反应环境条件，将纯化后的重组蛋白的浓度调整到38.4 µg/mL、19.2 µg/mL、9.6 µg/mL、4.8 µg/mL、2.4 µg/mL、1.2 µg/mL、0.6 µg/mL，包被96孔板，100 µL/孔，4 ℃过夜。每孔加入200 µL封闭液，37 ℃下孵育1 h。ASFV阳性血清和阴性血清为一抗，分别稀释到1∶25、1∶50、1∶100、1∶200，100 µL/孔，37 ℃下孵育1 h。HRP标记的山羊抗猪IgG为二抗，100 µL/孔，37 ℃孵育1 h。加入TMB显色液，100 µL/孔，37 ℃孵育10 min，之后加入显色终止液，酶标仪上机读数，根据P/N值确定最佳包被浓度和血清最佳稀释倍数。

1.8.2 特异性试验

选取猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪口蹄疫病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒的阳性血清，每个10份，并设定ASFV阳性血清和相关的阴性对照，使用已经优化的条件进行间接ELISA检测。

1.8.3 灵敏度试验

将ASFV阳性血清依照1∶25、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400的要求进行调整，使用优化后的条件对其进行间接ELISA测定，明确阳性血清需要稀释的最大数值。

1.8.4 重复性试验

组内重复性试验：用同一次包被的96孔板检测ASFV血清10份，每份做5个复孔；组间重复性试验：用5次包被的96孔板检测ASFV血清10份。

2 结果与分析

2.1 重组质粒的构建

利用设计的引物成功扩增AFSVp54基因，经琼脂糖凝胶电泳检测，得到522 bp长度的目的片段(图1)，与设计结果一致。将目的基因连接至pGEX-6P-1原核表达质粒，得到pGEX-6P-1-p54质粒，经BamHI、XhoI双酶切鉴定(图2)及测序结果，显示pGEX-6P-1-p54重组质粒构建成功。

2.2 重组质粒的诱导表达

将重组质粒与pGEX-6P-1空载体分别进行转化试验，在大肠杆菌BL21中进行诱导表达，同时用未诱导菌作为阴性对照组，SDSPAGE分析蛋白表达水平。结果显示，pGEX-6P-1空载体表达GST标签为26 kDa，与GST标签重组的蛋白分子量约为46 kDa，与理论值一致(图3)。

2.3 表达条件的优化确定

将目的蛋白诱导的温度、IPTG终浓度、诱导时间三个条件进行优化，经SDS-PAGE分析，结果表明当诱导温度为30 ℃，IPTG浓度为0.8 mmol/L、离心速度为220 r/min、反应时间为8 h时，表达量最大(图4、图5、图6)。

2.4 免疫印迹检测重组蛋白

在试验中，分别用GST标签抗体和ASFV阳性血清为一抗，对重组蛋白进行免疫印迹分析。结果显示，优化后的重组蛋白与GST抗体和ASFV阳性血清均发生特异性反应，在46 kDa处均有明显特异性条带(图7、图8)，两次结果与SDS-PAGE分析结果和蛋白分子量计算值一致。

2.5 间接ELISA条件的确定

2.5.1 重组蛋白最佳包被浓度和血清最佳稀释倍数

将上述已经纯化好的重组蛋白按照38.4 µg/mL、19.2 µg/mL、9.6 µg/mL、4.8 µg/mL、2.4 µg/mL、1.2 µg/mL、0.6 µg/mL的指标进行调整，ASFV阳性血清和阴性血清为一抗，分别稀释到1∶25、1∶50、1∶100、1∶200，结果如表1所示，抗原包被浓度最终需要调整到1.2 µg/mL，血清稀释程度达到1∶100时该物质的OD450nm值接近于1，在这个过程中P/N值是高的，所以重组蛋白最好的包被浓度需要达到1.2 µg/mL，血清最佳稀释倍数1∶100。根据OD450nm的x-值，被检测样本大于0.313可以评判为阳性，低于这一数值可以评判为阴性。

2.5.2 特异性试验

用建立的ELISA方法分别以猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪口蹄疫病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒的阳性血清学为一抗，进行对比测定，结果如图9所示。六种病毒的血清OD450nm值均低于0.313，检测结果均为阴性，证明建立的ELISA方法具有良好的特异性。

2.5.3 特异性试验

将ASFV阳性血清(原始浓度为38.4 μg/mL)按照1∶25、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400的倍数进行稀释，采用优化后的条件进行间接ELISA检测，其数据如图10所示。由图10可知，当该病毒阳性血清稀释到1∶1 600时，OD450nm值依然高于0.313，证明建立的ELISA方法具有较好的敏感性。

2.5.4 重复性试验

分别通过组内重复性试验与组间重复性试验，结果如图11所示，组内变异系数与组间变异系数都小于10%，这证实所建立的ELISA方法具有比较可观的重复性。

3 讨论

ASF属于一类热性、出血性传染病，临床主要以高热、淋巴结及脏器严重出血为特征，具有较高的接触传染性，所有品种和年龄段的猪均可感染，发病率和死亡率较高，ASFV强毒株的致死率可达100%，严重威胁全球养猪业。目前ASF尚无有效的预防和治疗措施，所以规模化猪场需要结合早期检测和实时监控等方法方能有效防控ASF[8]。ASF与经典猪瘟、猪丹毒等疾病具有相似的临床症状，在进行鉴别诊断时，可以采用病毒分离、血清学检测、免疫荧光法、免疫组化法以及核酸检测等多种比较常见的方法，目前血清学检测法已得到了广泛的应用，不仅所需成本低，而且具有较高的准确性，便于操作处理，适用于大多数猪场实验室进行诊断操作，所以建立一种灵敏度高且特异性强的ASFV血清学检测方法有助于ASF的防控[9-11]。目前，在实验室常规的血清学诊断方法中，OIE首选ELISA方法作为诊断ASFV的血清学方法，该方法具有操作简便、特异性较好、灵敏度高的特点，对实验室的硬件和实验人员的操作水平要求较低，可同时检测大批量样本。

经研究发现，ASFV表达的蛋白多达150余种，其中p30蛋白、p54蛋白、p72蛋白具备血清学诊断价值[12-14]。p54蛋白主要位于病毒的内囊膜上，具有良好的免疫原性。同时，p54蛋白在病毒衣壳的运输和诱导细胞凋亡方面发挥重要作用[15]。所以，重组蛋白p54可以作为良好的诊断抗原，用于ASFV感染中期或者后期的血清学诊断。

本研究主要参考了发布于GenBank上的从中国的发病猪上分离的ASFVp54基因序列，并优化大肠杆菌密码子，在全序列克隆基因之后，通过原核表达的方式，对可溶性重组蛋白GST-p54进行表达，且该蛋白的反应原性较佳。通过对p54蛋白原核表达体系的探索，建立了大量制备可溶性p54蛋白的体系，可用于后续的抗体制备、ELISA试剂的研制以及蛋白结晶的解析等，具有潜在的应用研究和基础研究价值。

本研究选择的包被抗原——GST-p54重组蛋白，通过优化反应条件，构建了ASFV抗体间接ELISA检测方式。试验结果表明，此种方式具有良好的重复性与敏感性，而且特异性较佳，具有重要的研究意义。