尹世伟，崔玉兰，贾小玉，赵 婷，崔宇晖，康丽艳

(1. 邯郸市第一医院，河北 邯郸 056000；2. 河北省第八人民医院，河北 石家庄 050000；3. 邯郸市第二医院，河北 邯郸 056000；4. 文安县医院，河北 文安 065800)

2型糖尿病是临床上最常见的内分泌疾病，发病原因涉及遗传和环境因素。国际糖尿病联合会的数据显示，2型糖尿病的发病人数在世界范围内呈显著性增加趋势，尤其是在肥胖人群中，而持续高血糖水平会引发诸多并发症[1]。2型糖尿病的核心发病机制包括胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能下降，导致血糖水平失调[2]。在生理条件下，机体葡萄糖/血糖稳态水平是通过葡萄糖摄取和葡萄糖生成之间的动态平衡实现的，葡萄糖摄取主要由其他外周组织(如脂肪、肌肉和脑组织)介导，体内通过肝糖异生[3]，在糖尿病状态下葡萄糖生成超过全身葡萄糖摄取导致血糖水平失调。目前已经证明抑制肝糖异生是治疗2型糖尿病的有效策略。肝糖异生主要由胰岛素和胰高血糖素调节[4]，生理上与胰岛素结合的受体称为胰岛素受体底物(IRS)，包括 IRS-1和IRS-2，在胰岛素信号通路中发挥着重要作用。研究表明，IRS-1是磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的主要对接蛋白，与细胞摄取葡萄糖的增加有关[5]。除此之外，当2型糖尿病病情发展时，肝细胞中胰岛素激活的PI3K/蛋白激酶B(Akt2)信号通路受损[6-7]。当归补血汤是益气补血的良方，具有降低血糖的作用，但其机制尚不明确。本实验从IRS-1/PI3K/Akt2信号通路的角度出发，探讨了当归补血汤治疗2型糖尿病的作用机制。

1 实验材料与方法

1.1动物 清洁级雄性ZDF(fa/+)大鼠8只和ZDF(fa/fa)大鼠24只，7～8周龄，体重200～220 g， 均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK(京)2021-0011。大鼠在河北工程大学实验动物中心[实验动物设施许可证号：SYXK(冀)2015-0005]饲养， 饲养环境：温度21～25 ℃，相对湿度50%～60%，光照条件为12 h，采用自由饮水摄食模式适应环境1周。

1.2药物 当归补血汤由黄芪30 g、当归6 g组成，黄芪购于安徽济人药业有限公司，批号为1704062，当归购于华润三九医药股份有限公司，批号为1307144，上述用药均为中药配方颗粒。大鼠的受试剂量为临床用量的10倍，即12.8 g/kg。盐酸二甲双胍片购于中美上海施贵宝制药有限公司，国药准字H20023370，大鼠的受试剂量为临床用量的10倍，即300 mg/kg。

1.3分组、造模及干预 8只雄性ZDF(fa/+)大鼠作为对照组；24只雄性ZDF(fa/fa)大鼠给予高脂饲料喂养3周建立2型糖尿病模型，期间监测随机血糖，以任意2 d随机血糖≥16.7 mmol/L表明造模成功，将造模成功大鼠随机分为模型组、盐酸二甲双胍组、当归补血汤组各8只。盐酸二甲双胍组给予盐酸二甲双胍肠溶片300 mg/kg灌胃，当归补血汤组给予当归补血汤12.8 g/kg灌胃，对照组和模型组给予等量生理盐水灌胃，均1次/d，连续 8周。

1.4观察指标及方法

1.4.1口服葡萄糖耐量试验 末次灌胃结束禁食14 h后，各组大鼠尾静脉取血，使用血糖仪[HGM-125T，欧姆龙健康医疗(中国)有限公司]检测空腹血糖水平，使用ELISA试剂盒(Abcam，中国)检测空腹胰岛素水平，之后大鼠灌胃40%葡萄糖溶液2 g/kg，分别检测灌胃后30，60，120，180 min血糖水平和灌胃后30 min胰岛素水平，计算血糖曲线下面积(AUC)、胰岛素生成指数[胰岛素生成指数=(30 min胰岛素水平-空腹胰岛素水平)/(30 min血糖水平-空腹血糖水平)]、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)[HOMA-IR=空腹血糖×空腹胰岛素/22.5]和胰岛β细胞功能指数(HOMA-β)[HOMA-β=空腹胰岛素×20/(空腹血糖-3.5)]。

1.4.2血清肝酶及血脂水平 口服葡萄糖耐量试验实验结束，隔天禁食12 h，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉采血，4 ℃下3 000 r/min离心10 min，取上清，采用全自动血生化仪器(AU2700型全自动生化分析，美国贝克曼-库尔特公司)检测血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平。

1.4.3肝组织中IRS-1、PI3Kp85、Akt2 mRNA表达情况 取血完毕后颈椎脱臼法处死大鼠后分离肝脏组织。采用TRIzol试剂(赛默飞，15596026)从肝脏组织中提取总RNA，每个RNA样本为1 μg，测定浓度并进行 RNA鉴定，使用SuperScript IV反转录酶(赛默飞，18091050)将mRNA反转录成互补DNA(cDNA)。按GoTaq®Probe qPCR Master Mix荧光定量试剂盒[翌圣生物科技(上海)股份有限公司，promega A6001]说明书进行相关操作，RT-PCR采用热循环反应程序设置，首先95 ℃作用3 min，35个循环，然后变性 95 ℃ 30 s、退火 58 ℃ 30 s、延伸 72 ℃ 30 s，重复3次实验。IRS-1引物序列：上游5’-GGCACCATCTCAACAATC-3’，下游5’-GTTTCCCACCCACCATAC-3’，长度105 bp；PI3Kp85引物序列：上游5’-ACTACTGGGGAGAGGGGAGA-3’，下游5’-AACATCAGGAGGGGCAAAC-3’，长度198 bp；Akt2引物序列：上游5’-CACAGAGAGCCGAGTCCTACA-3’，下游5’-GGCATACTCCATCACAAAGCA-3’，长度103 bp。以Rn18s作为管家基因。采用△△CT方法计算基因的相对表达量，用2-△△CT表示。

1.4.4肝脏组织中 IRS-1、PI3Kp85、Akt2蛋白表达情况 采用 Western blot法检测：研钵中倒入液氮，加入大鼠肝脏组织块研磨，药匙刮下后放入1.5 mL的EP管，加适量裂解液，冰上放置1 h，期间每隔10～15 min吹打1次，离心机在4 ℃下12 000 r/min离心(离心半径为15 cm)60 min，取上清液，加1/4体积5×loading buffer，煮沸，分装。标准孔按说明书先加超纯水，再加标准蛋白液，目的孔每孔加18 μL超纯水和2 μL目的蛋白，按说明书配BCA工作液，每孔加200 μL，37 ℃放置30 min后测蛋白浓度。取每组蛋白30 μg 在SDS-PAGE凝胶上进行电泳分离，转PVDF膜，封闭1 h后，加入一抗4 ℃孵育过夜。磷酸盐聚山梨酯缓冲液(PBST)洗膜4次后，加入二抗(1∶2 000)室温孵育2 h，PBST 再次清洗4次，加入ECL超敏发光液后化学发光成像系统曝光后分析目的蛋白条带灰度值，并以 B-actin条带灰度值为参考，计算 IRS-1、PI3Kp85、Akt2、p-IRS1、p-PI3Kp85、p-Akt2蛋白的相对表达量。

2 结 果

2.1各组大鼠血糖相关指标比较 模型组大鼠空腹血糖水平、空腹胰岛素水平、血糖曲线下面积、HOMA-IR均明显高于对照组(P均<0.05)，胰岛素生成指数、HOMA-β均明显低于对照组(P均<0.05)；盐酸二甲双胍组和当归补血汤组空腹血糖水平、空腹胰岛素水平、血糖曲线下面积、HOMA-IR均明显低于模型组(P均<0.05)，胰岛素生成指数、HOMA-β均明显高于模型组(P均<0.05)，当归补血汤组各指标改善情况均明显优于盐酸二甲双胍组(P均<0.05)。见图1及表1。

表1 对照组和2型糖尿病各组大鼠血糖相关指标比较

图1 对照组和2型糖尿病各组大鼠口服葡萄糖耐量试验血糖变化曲线

2.2各组大鼠血清生化参数比较 与对照组比较，模型组大鼠血清ALT、AST、TC、TG、LDL-C水平均明显升高(P均<0.05)，HDL-C水平明显降低(P<0.05)；与模型组比较，盐酸二甲双胍组和当归补血汤组大鼠血清ALT、AST、TC、TG、LDL-C水平均明显降低(P均<0.05)，HDL-C水平均明显降低(P均<0.05)；除ALT、TC外，当归补血汤组AST、TG、LDL-C、HDL-C改善情况均明显优于盐酸二甲双胍组(P均<0.05)。见表2。

表2 对照组和2型糖尿病各组大鼠血清生化参数比较

2.3各组大鼠肝脏组织中IRS-1、PI3Kp85及Akt2 mRNA表达量比较 模型组大鼠肝脏组织中IRS-1、PI3Kp85、Akt2 mRNA表达量均明显低于对照组(P均<0.05)，盐酸二甲双胍组和当归补血汤组IRS-1、PI3Kp85、Akt2 mRNA表达量均明显高于模型组(P均<0.05),当归补血汤组IRS-1、PI3Kp85 mRNA表达量均明显高于盐酸二甲双胍组(P均<0.05)。见表3。

表3 对照组和2型糖尿病各组大鼠肝脏组织中IRS-1、PI3Kp85 及Akt2 mRNA相对表达量比较

2.4各组大鼠肝脏组织中IRS-1、p-IRS1、 PI3Kp85、p-PI3Kp85、Akt2、p-Akt2蛋白表达量比较 模型组大鼠肝脏组织中IRS-1、p-IRS1、 PI3Kp85、p-PI3Kp85、Akt2、p-Akt2蛋白表达量均明显低于对照组(P均<0.05)，盐酸二甲双胍组和当归补血汤组肝脏组织中IRS-1、p-IRS1、 PI3Kp85、p-PI3Kp85、Akt2、p-Akt2蛋白表达量均明显高于模型组(P均<0.05)，当归补血汤组IRS-1、p-IRS1、 PI3Kp85、p-PI3Kp85、Akt2蛋白表达量均明显高于盐酸二甲双胍组(P均<0.05)。见表4。

表4 对照组和2型糖尿病各组大鼠肝脏组织中IRS-1、p-IRS1、 PI3Kp85、p-PI3Kp85、Akt2、p-Akt2蛋白相对表达量比较

3 讨 论

糖尿病是影响碳水化合物和脂质代谢的常见内分泌疾病之一，临床中以2型糖尿病常见。生理状态下，肝脏对于维持正常的葡萄糖水平至关重要，在空腹时其可产生葡萄糖，在餐后可储存葡萄糖；胰岛素可抑制糖原分解，刺激糖原合成，减少糖异生。病理状态时，胰岛素抵抗使糖原分解和糖异生增加，肝脏将过量的葡萄糖释放到血液中，另一方面糖酵解和糖生成减少导致血糖消耗减少，最终导致体内血糖水平过高[8]。目前研究认为激活的胰岛素信号通路对肝内糖原分解、糖原合成、糖异生和葡萄糖代谢有明显影响，抑制肝葡萄糖产生是治疗2型糖尿病的有效途径，临床中常以盐酸二甲双胍抑制肝葡萄糖产生[9]。

肝葡萄糖的产生主要由胰岛素和胰高血糖素调节，而胰岛素作用包括一系列由胰岛素与其受体结合引发的信号级联反应，导致受体自身磷酸化和受体酪氨酸激酶的激活，其中IRS的酪氨酸磷酸化是胰岛素刺激葡萄糖转运的必要步骤[9]。胰岛素抵抗素激活PI3K磷酸化主要是由胰岛素反应性葡萄糖转运体GLUT4从细胞内囊泡转移到质膜而引起的，胰岛素刺激的PI3K激活导致GLUT4易位的下游途径尚不清楚，但Akt可能是介导这一过程的候选分子。由此可见，PI3K激活对于胰岛素和其他因子激活(如Akt)非常重要。此外，PI3K的脂质产物如磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸[PI(3，4，5)P3]-依赖性蛋白激酶1(PDK-1)对Akt的磷酸化是Akt活化的重要步骤[10]。虽然Akt激活对胰岛素代谢作用的重要性尚不清楚，但目前支持Akt作用的研究发现，在大鼠和人类体内注射胰岛素可快速激活骨骼肌中的Akt，Akt具有抑制糖原合酶激酶-3(GSK-3)的能力，表明Akt可能在糖原合成中发挥作用，且Akt可能通过激活磷酸果糖激酶2(PFK2)来调节糖酵解[11-12]。

目前，临床上用于治疗2型糖尿病的药物包括胰岛素增敏剂、促胰岛素分泌药物、二甲双胍类、胰岛素及其类似药物、GLP-1受体激动剂等，但有些患者的血糖控制仍不理想，且有低血糖、胃肠不适等不良反应。因此迫切需要发现新型、有效、不良反应更小的药物来治疗2型糖尿病。中医学为2型糖尿病的治疗提供了更多的思路。因此，许多研究人员致力于开发对2型糖尿病患者不良反应更小的中药疗法[12]。

糖尿病属于中医“消渴”范畴，病机以气阴两虚为主，益气养阴被公认为核心治疗方向。当归补血汤是一个可有效干预2型糖尿病的经典中药组方，由黄芪和当归按照5∶1比例组成。黄芪味甘，气微温，可升可降，阳中之阳也，无毒，专补气，是最常用的补气药；当归味甘辛，气温，可升可降，阳中之阴，无毒，虽有上下之分，而补血则一，是最常用的活血药；两药合用，非常符合2型糖尿病的病机。黄芪的研究主要集中在生物活性成分和改良方，黄芪中含有单糖、多糖、皂甙、黄酮、氨基酸、蛋白质、叶酸、核黄素、维生素P等多种成分，可明显降低血糖，促进胰岛素和C肽的分泌[13-15]。当归含有当归多糖、纤维素、阿魏酸等成分，具有促进消化、提高机体免疫力等作用[16]。周珍等[17]报道，当归补血汤的降糖作用可能与增强GLUT4蛋白的表达,改善胰岛素抵抗有关。孙丽丽等[18]运用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱技术检测发现，当归补血汤可通过提高2型糖尿病小鼠机体对胰岛素的敏感性、调节糖脂代谢紊乱、减轻炎症反应等缓解病情。

本实验结果显示，模型组大鼠空腹血糖和空腹胰岛素水平、血糖曲线下面积、HOMA-IR均高于对照组，胰岛素生成指数、HOMA-β均低于对照组，当归补血汤组各指标均较模型组明显改善，证实当归补血汤具有明显降糖和改善胰岛素抵抗作用。胰岛素抵抗可以导致脂质代谢紊乱，使肝脏脂肪变性，引起肝细胞损伤，本实验中模型组大鼠存在明显肝酶和血脂异常，当归补血汤组肝酶和血脂异常均明显改善，分析与当归补血汤可改善胰岛素抵抗有关。通过检测IRS-1/PI3K/Akt2信号通路相关指标显示，模型组大鼠肝脏组织中IRS-1、PI3Kp85、Akt2 mRNA表达量和IRS-1、p-IRS1、PI3Kp85、p-PI3Kp85、Akt2、p-Akt2蛋白表达量均明显低于对照组，当归补血汤组上述各指标表达量均明显高于模型组，提示当归补血汤改善胰岛素抵抗可能是通过影响IRS-1/PI3K/ Akt2信号通路而介导的。

综上所述，2型糖尿病的病机复杂，是多条信号通路共同作用的结果，当归补血汤治疗2型糖尿病的作用可能与影响IRS-1/PI3K/Akt2信号通路有关，但其作用机制仍待进一步研究探讨。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。