刘 畅，李常慧，王姝元,区益洲，缪晓路

(1. 广州中医药大学，广东 广州 510006；2. 广州中医药大学东莞医院，广东 东莞 523005)

帕金森病是一种常见的进行性退行性的中枢神经系统疾病，多发生于50岁以上的老年人[1-2]。目前认为帕金森病主要病理特征是黑质多巴胺能神经元变性缺失导致基底神经节多巴胺水平下降、路易小体形成[3]、α突触核蛋白沉积。Svensson等[4]提出“帕金森病的发生可能开始于胃肠道，并通过迷走神经传播到大脑”的假说。帕金森病患者肠道菌群会发生失调，总体表现为致病菌明显增多，益生菌显著减少[5]。而肠道菌群失调可加剧1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的帕金森病小鼠模型提前出现运动行为学改变[6]。笔者在临床中发现基于“益脾通腑法”白术与虎杖配伍的基础方可以改善消化系统、心血管系统症状，有利于帕金森病运动功能的改善。基于此，本实验从脑-肠-微生物轴角度探讨了术虎合剂对帕金森病的作用机制，旨在为其能在临床推广应用提供实验依据。

1 实验材料与方法

1.1动物 SPF级6～8周C57BL/6雄性小鼠，体重(20±2)g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，生产许可证号：SCXK(京)2019-0008，实验室许可证号：SYXK(粤)2019-0202。饲养环境的室温为(22±2)℃，昼夜自然明暗交替照明，自由饮水。

1.2主要仪器 小鼠爬杆实验装置(江苏赛昂斯生物科技有限公司)；冻台、脱水机及包埋机(武汉俊杰电子有限公司)；组织摊片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)；病理切片机(上海徕卡仪器有限公司)；正置光学显微镜(日本尼康)。

1.3药物及试剂 白术、虎杖中药配方颗粒(广东一方制药有限公司)；无水乙醇、二甲苯、冰醋酸(国药集团化学试剂有限公司)；MPTP(美伦生物有限公司，MB3783)；HE染液试剂盒(索莱宝，货号：G1120)；EDTA(pH9.0)、4%多聚甲醛(Servicebio，货号：G1101)；甲苯胺蓝染液(阿拉丁，货号：T104232)；酪氨酸羟化酶一抗(美国 Abcam，ab137869，1∶500)，HRP标记山羊抗兔IgG(美国 Abcam，ab6721，1∶2 000)。

1.4药物制备 生药白术10 g相当于取白术配方颗粒5.35 g，与200 mL蒸馏水配制成质量浓度为27.5 mg/mL的汤剂；生药虎杖10 g相当于取虎杖配方颗粒2g，与200mL蒸馏水配制成质量浓度为10 mg/mL的汤剂；生药白术20 g+虎杖10 g相当于取白术配方颗粒10.70 g与虎杖配方颗粒2 g与200 mL蒸馏水中配制成质量浓度为65 mg/mL的汤剂。

1.5实验方法 将60只C57BL/6雄性小鼠随机分为正常组、模型组、白术组、虎杖组、术虎合剂组，每组12只。参考文献[7],正常组给予生理盐水腹腔注射，其余组采用MPTP 30 mg/kg腹腔注射建立帕金森模型，均持续7 d，在此期间每天通过旷场实验[8]和爬杆实验[9]检测小鼠的运动协调能力。模型建立成功后，白术组给予27.5 mg/mL白术汤剂灌胃，虎杖组给予10 mg/mL虎杖汤剂灌胃，术虎合剂组给予65 mg/mL术虎合剂灌胃，空白组及模型组给予蒸馏水灌胃，灌胃量均为0.2 mL/10 g，1次/d，均连续灌胃2周。

1.6检测指标及方法

1.6.1小鼠行为能力检测 末次灌胃后，对各组小鼠进行旷场实验和爬杆实验，记录前爪步距、掉头时间、下杆时间。

1.6.2脑组织HE染色病理观察 各组小鼠行为能力检测结束后处死，取部分脑组织，以PBS缓冲液进行清洗后，将脑组织放于4%多聚甲醛中固定，并依次进行脱水、石蜡包埋、切片(5～6 μm)、HE染色，在光学显微镜下进行观察。

1.6.3脑黑质神经元尼氏小体Nissl染色观察 取各组小鼠脑组织，依照鼠脑图谱分离出中脑黑质，用4%多聚甲醛固定，再浸入30 %蔗糖磷酸缓冲溶液中进行脱水，直至黑质组织下沉。用切片机进行连续冠状切片，片厚为10 μm。用1%甲苯胺蓝水溶液置温箱(50～60 ℃)染色20～40 min，用蒸馏水冲洗。再加入95%乙醇迅速分化，继而加入酸化伊红浸泡20 min。然后用95%乙醇迅速分化后，用无水乙醇脱水，二甲苯进行透明，再用中性树胶进行封固。运用全自动图形分析系统进行形态学观察。每组随机选取1张切片，每张切片随机选择3个视野，放大20×20的倍数进行观测，以3个视野的平均数代表该只小鼠脑黑质中尼氏小体的含量。

1.6.4肠道菌群16S rRNA检测分析 ①收集正常组、模型组和术虎合剂组小鼠盲肠内容物并于-80 ℃冰箱保存。使用E.Z.N.A.®soil试剂盒(Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)提取各组小鼠粪便DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，利用NanoDroP2000检测DNA浓度和纯度，保存在-20 ℃冰箱中备用。②16S rRNA扩增子测序：以各个样本的总DNA为模板,使用338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)引物对V3～V4可变区进行PCR扩增。③信息分析流程：用qiime tools import 插件，将原始序列fastq文件，导入为可进行QIIME2后续处理的文件格式。运用QIIME2 dada2插件质量控制、修剪、去噪、拼接及去除嵌合体后，运用QIIME2 feature-classifier插件将ASV的代表序列比对到GREENGENES数据库，得到物种的分类信息表。采用ANOVA、LEfSe方法进行分组鉴定及鉴定样本间丰度有差异的细菌。最终对数据信息进行物种注释、AlpHa多样性指数统计分析(Shannon指数用于观察群落多样性，与群落中物种丰度和物种均匀度有关；Chao1指数用于观察群落的丰度)、Beta多样性无度量多维标定法(NMDS)分析、细菌物种组间差异LEfSe分析(寻找特征微生物)、KEGG数据库预测样品微生物组成功能通路。

2 结 果

2.1各组小鼠行为学情况 各组小鼠旷场实验前爪步距比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。爬杆实验中，模型组小鼠掉头时间、下杆时间均明显长于正常组(P均<0.05)，白术组、虎杖组、术虎合剂组小鼠掉头时间、下杆时间均明显短于模型组(P均<0.05)，且术虎合剂组小鼠掉头时间明显短于虎杖组(P<0.05)。见表1。

表1 正常组和帕金森病各组小鼠行为学实验结果比较

2.2各组小鼠脑组织HE染色表现 正常组小鼠脑组织细胞核清晰，中脑黑质神经元形态完整；模型组小鼠神经元数目减少，核仁模糊；与模型组相比，各药物组小鼠神经元数量增加，其中术虎合剂组神经细胞数量最多。见图1。

图1 正常组和帕金森病各组小鼠脑组织HE染色病理表现(×400)

2.3各组小鼠Nissl染色黑质神经元尼氏小体形态与数量 正常组小鼠黑质致密带神经元结构形态正常，细胞核淡染，核仁显影明显，细胞质呈蓝色，尼氏小体呈现紫蓝色着色，清晰可见，分布在细胞核的周围，尼氏小体的数量为183个；模型组小鼠黑质致密带神经元数目明显减少，细胞核固缩或偏移，部分核仁可见，细胞质中央尼氏小体溶解消失，胞质呈苍白均质状，完整神经元数目明显减少，黑质中尼氏小体的数量为73个，明显少于正常组(P<0.05)；白术组和虎杖组小鼠神经细胞形态部分恢复，术虎合剂组小鼠神经细胞形态恢复正常，尼氏小体数量分别为163个、87个及216个，均明显多于模型组(P均<0.05)，其中术虎合剂组尼氏小体数量与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2 正常组和帕金森病各组小鼠脑组织Nissl染色黑质部尼氏小体形态(×400)

2.4各组小鼠肠道菌群情况

2.4.1物种注释结果

2.4.1.1门分类水平 正常组、模型组、术虎合剂组主要以厚壁菌门(Firmicutes,66.2%，60.9%，52.2%)、拟杆菌门(Bacteroidetes,23.1%，11.6%，11.8%)、疣微菌门(Verrucomicrobia,4.5%，8.7%，26.5%)、变形菌门(Proteobacteria,3.5%，13.9%，2.5%)为主，这4种细菌在各组小鼠粪便细菌中的占比大。与正常组比较，模型组拟杆菌门和厚壁菌门比例下降，疣微菌门及变形菌门比例升高；与模型组比较，术虎合剂组厚壁菌门和变形菌门比例降低，疣微菌门比例升高。见图3。

图3 正常组和帕金森病各组小鼠肠道菌群门分类水平下的物种叠加柱形图

2.4.1.2科分类水平 正常组、模型组、白术虎杖组主要以属于厚壁菌门的毛螺菌科(Lachnospiraceae,22.4%，13.1%，16.4%)、属于梭菌属(Clostridium,26.9%，11.5%，10.9%)、属于拟杆菌门的S24-7菌科(Muribaculaceae,20.1%，9.7%，10.3%)、属于疣微菌门的疣微菌科(Verrucomicrobiaceae,4.5%，8.6%，26.5%)、丹毒丝菌科(Erysipelotrichaceae,8.2%，4.0%，8.0%)为主。与正常组比较，模型组毛螺菌科、梭菌科、Muribaculaceae比例均明显下降，疣微菌科比例明显升高；与模型组比较，术虎合剂组毛螺菌科、疣微菌科比例升高，与门水平结果一致。见图4。

图4 正常组和帕金森病各组小鼠肠道菌群科分类水平下的物种叠加柱形图

2.4.1.3属分类水平 正常组、模型组、术虎合剂组主要以未标明的梭菌属(Clostridium,26.9%，11.5%，10.9%)、阿克曼菌属(Akkermansiaceae,4.5%，8.7%，26.5%)、Muribaculaceae(20.1%，9.6%，10.3%)、毛螺菌属(Lachnospiraceae,19.6%，11.5%，13.3%)、Allobaculum(7.9%，3.6%，7.3%)为主。与模型组比较，术虎合剂组阿克曼菌属、Allobaculum比例升高。见图5。

图5 正常组和帕金森病各组小鼠肠道菌群属分类水平下的物种叠加柱形图

2.4.2AlpHa多样性指数统计分析 模型组Shannon指数和Chao指数均明显低于正常组(P均<0.05)，术虎合剂组均明显高于模型组(P均<0.05)。见表2。

表2 正常组和帕金森病各组小鼠肠道菌群AlpHa多样性指数分析

2.4.3Beta多样性NMDS分析 基于Unweighted Unifrac距离进行Beta多样性NMDS分析(见图6)，图中的点代表样本，不同颜色的点归属于不同的样本组，点到点之间的距离代表样本菌群差异程度，两点之间的距离越近，提示两个样本之间的微生物群落结构具有越高的相似度。Stress=0.1814<0.2，故此分析可靠。术虎合剂组和正常组距离接近，组内差异性小，表明微生物群落结构相似；模型组内样本点距离较远，个别点与术虎合剂组、正常组距离较远，表明模型组和正常组微生物群落结构有差异性。

图6 正常组和帕金森病各组小鼠肠道菌群Beta多样性NMDS分析

2.4.4细菌物种组间差异LEfSe分析 以LDA阈值等于4测量代表微生物具有显著差异，结果模型组与正常组相比，主要在1个菌门、3个菌纲、4个菌目、5个菌科、5个菌属有显著差异，其中正常组中出现最明显改变的菌科是毛螺菌科(LachnosPiraceae)，模型组中杆菌纲(Bacilli)、变形菌门(Proteobacteria)、乳酸杆菌目(Lactobacillales)、丙型变形菌纲(Gammaproteobacteria)的相对丰度明显增加；与模型组相比，术虎合剂组主要在2个菌门、3个菌纲、5个菌目、4个菌科、5个菌属上有明显差异，其中阿克曼菌科(Akkermansl)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)改变最显著。见图7。

图7 正常组和帕金森病各组小鼠肠道菌群物种组间差异LEfSe分析

2.4.5样品微生物组成功能通路预测 使用PICRUSt2对代表性序列进行功能预测分析，得到MetaCyc数据库通路的百分比组成柱形图(见图8)。与模型组相比，术虎合剂组显著上调的通路有5条，分别为ANAGLYCOLYSIS-PWY(糖酵解Ⅲ)、PWY-5104(L-异亮氨酸生物合成Ⅳ)、PWY-5686(UMP生物合成)、CALVIN-PWY(卡尔文循环)、BRANCHED-CHAIN-AA-SYN-PWY(支链氨基酸生物合成的超途径)。

图8 正常组和帕金森病各组小鼠肠道菌群MetaCyc通路预测组成柱形图

3 讨 论

帕金森病是一种以运动减少、姿势障碍及肢体震颤为主要临床表现的脑退行性疾病，属于中医学“颤证”“拘证”等的范畴，病位在脑。中医认为“夫脑者，一身之宗，百神之会”(《修真十书》)，其部位及功能与现代西医学的“脑”基本是一致的。中医脾胃学说与脑有着密切的联系，以脾胃学说为基础对脑退行性疾病进行防治有着重要的价值[10]。清·何梦瑶《医碥》曰：“颤，摇也；振，战动也，亦风火摇撼之象，由水虚而然，风木盛则脾土虚。”而肠道菌群平衡是脾主运化的主要生理功能[11]。张锡纯《医学衷中参西录》曰：“饮食入胃不能传送下行，上则为胀满，下则为便结。”故笔者认为对帕金森病来说，脑-肠-微生物轴非常恰当地解释了脑与中医脾胃的相关性，脾虚腑实证是帕金森病常见的中医临床证候。白术生用可健脾益气，大剂量应用时通补兼具；虎杖味微苦，性微寒，功能泻下通便。现代研究发现，重用白术能够改善帕金森患者诸症[12]；虎杖中含有的白藜芦醇对帕金森病小鼠黑质多巴胺能神经元具有保护作用，能够明显改善帕金森病小鼠的行为能力[13]。

本实验中行为学结果显示，白术组、虎杖组、术虎合剂组小鼠掉头时间、下杆时间均明显短于模型组，且术虎合剂组小鼠掉头时间明显短于虎杖组，提示益脾法、通腑法对帕金森病小鼠的行为能力有改善作用，而基于益脾通腑法的术虎合剂的改善作用更明显。组织病理观察显示：帕金森病小鼠黑质神经元尼氏小体严重损伤，术虎合剂组黑质神经元尼氏小体量明显增加，提示基于益脾通腑法的术虎合剂可以改善帕金森病小鼠的脑组织病理结构。在肠道菌群方面，帕金森病小鼠肠道菌群结构发生紊乱，拟杆菌门和厚壁菌门比例下降，疣微菌门及变形菌门比例升高，Chao1指数、Shannon指数显著降低，LEfSe分析结果显示杆菌纲、变形菌门、乳酸杆菌目、丙型变形菌纲是帕金森病小鼠肠道中的特征性菌群；术虎合剂组变形菌门比例下降，疣微菌门比例升高，Chao1指数、Shannon指数显著升高，LEfSe分析显示阿克曼菌科、疣微菌科显著改变，提示术虎合剂可提高帕金森病小鼠肠道菌群丰富度及多样性，可明显调节小鼠肠道菌群中变形菌门及疣微菌门的相对丰度。

综上所述，益脾通腑法(术虎合剂)能通过调节肠道菌群，影响脑黑质中尼氏小体的含量，进而改善帕金森病小鼠的行为能力。笔者认为基于脑-肠-微生物轴的益脾通腑法是帕金森病治疗中一种有价值的中医治法。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。