苏 磊，胡梦圆，李玲玲，张昕雨，鲁 艺

(北京中医药大学中医学院，北京 100029)

衰老作为一种正常的生理现象普遍存在于自然界中，是指个体的年龄增长过程中细胞增殖功能逐渐减退，甚至不再更新，组织功能退化，从而导致器官的各种功能也出现退化，最终寿命终结的现象。与衰老相关的糖尿病、神经退行性病变、肿瘤、代谢性疾病以及各种心血管疾病等都是人类健康的重大威胁。根据世界卫生组织2018年发布的《World Health Statistics 2018》，我国人口2016年的平均预期寿命为76.4岁，而世界排名第一的日本平均预期寿命达到了84.2岁[1]。这说明我国的人均预期寿命还有很大的提升空间，因此抗衰老药物的研究与开发具有很重要的意义。根皮苷是一种二氢査耳黄酮,具有广泛的抗氧化、降血糖、消炎、抗肿瘤作用，对糖尿病小鼠主动脉有很好的保护作用[2]。根皮苷还可以增强果蝇的抗氧化能力，减少果蝇体内的自由基水平，调节体内内源性抗氧化酶系统的平衡[3-4]。但根皮苷对寿命的影响研究甚少。秀丽隐杆线虫(简称线虫)是一种常被用作研究寿命的模式生物，故本实验以线虫为研究对象，探讨了根皮苷对其寿命的影响。

1 实验材料与方法

1.1材料与仪器 根皮苷(纯度≥98%，分子量472.45)购自上海源叶生物科技有限公司; 野生型线虫和尿嘧啶缺陷型大肠杆菌(Eco.liOP50)由北京中医药大学刘永刚老师课题组惠赠；琼脂粉及蛋白胨购自北京拜尔迪生物技术有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台，苏州净化设备有限公司；SPX-100B-Z微电脑生化培养箱，上海博讯有限实业有限公司；Leica EZ4W体式显微镜，德国徕卡。

1.2实验方法

1.2.1线虫给药方式及常规培养 将根皮苷与E.coil OP50混合配制成相应浓度的药液，取50 μL滴加在NGM培养基上，晾干24 h后，将线虫转移到含药培养基上22 ℃恒温培养。

1.2.2线虫同步化 在无菌条件下挑取100条处于产卵期的成虫，放在一个铺有E.coilOP50的培养基上，待产卵3 h后将成虫全部转移。将余下的产卵板放置于22 ℃恒温生化培养箱中培养线虫至L4期，即得到同步化的L4期幼虫。

1.2.3急性热应激筛选实验 实验分为空白组、0.1 mg/mL根皮苷组、0.5 mg/mL根皮苷组、1 mg/mL根皮苷组，每组设置3个培养基，每个培养基含有10条同步化至L4期的线虫。根皮苷各组培养基中加入相应浓度根皮苷处理24 h后，与空白组同时平铺放置于35 ℃恒温培养箱中观察，每隔2 h将培养皿从培养箱中取出统计线虫的死亡数和存活数，直到全部线虫死亡，计算线虫的生存时间。线虫死亡判断标准为显微镜下虫体多次用铂丝触碰没有反应，虫体完全丧失运动能力。

1.2.4线虫寿命实验 根据急性热应激筛选实验，在根皮苷0.1 mg/mL浓度附近范围进行寿命实验。实验分为空白组、0.05 mg/mL根皮苷组、0.1 mg/mL根皮苷组、0.2 mg/mL根皮苷组，每组设置3个培养基，每个培养基含有30条同步化至L4期的线虫，根皮苷各组培养基中加入相应浓度根皮苷。实验过程中，为防止新生幼虫对计数的干扰，早期线虫每24 h更换1次含有相同药物浓度及E.coli OP50的NGM培养基，待没有新生幼虫后，每2 d更换1次培养基。每24 h统计1次线虫的死亡数和存活数，直至所有线虫死亡，所有个体的平均生存时间计为平均寿命，最长寿命取每个培养基中最后存活10%个体的寿命，线虫死亡判断标准同1.2.3实验。

1.2.5线虫应激实验 实验分为空白组、0.05 mg/mL根皮苷组、0.1 mg/mL根皮苷组、0.2 mg/mL根皮苷组，每组设置3个培养基，每个培养基含有20条同步化至L4期的线虫，根皮苷各组培养基中加入相应浓度根皮苷。在急性热应激实验中，将各组培养24 h后的线虫暴露于35 ℃恒温培养箱，每2 h统计1次线虫的死亡数和存活数，直至线虫全部死亡。在百草枯急性氧化应激实验中，将各组培养24 h后的线虫转移到含12.97 mg/mL百草枯的培养基中进行观察，每2 h统计1次线虫的死亡数和存活数，直至所有线虫死亡。线虫死亡标准同1.2.3实验。在过氧化氢急性氧化应激实验中，将各组培养24 h后的线虫暴露于0.4 mmol/L过氧化氢中，每12 h统计1次线虫的死亡数和存活数，直至线虫全部死亡。

1.2.6线虫生殖能力实验 实验分为空白组、0.05 mg/mL根皮苷组、0.1 mg/mL根皮苷组、0.2 mg/mL根皮苷组，每组设置12个培养基，每个培养基培养1条同步化至L4期的线虫，根皮苷各组培养基中加入相应浓度根皮苷。每24 h将线虫转移至新的培养基1次，直至线虫产卵期结束。产卵板在22 ℃的恒温生化培养箱中培养24 h后统计子代数目。每条线虫产卵期所有子代数目之和即为该线虫的产卵数，同时记录每条线虫整个产卵期时长。

2 结 果

2.1急性热应激筛选实验 在35 ℃急性热应激条件下，空白组、0.1 mg/mL根皮苷组、0.5 mg/mL根皮苷组、1 mg/mL根皮苷组线虫的生存时间分别为(6.07±0.22)h、(6.87±0.23)h、(6.13±0.19)h、(5.70±0.22)h，0.5 mg/mL根皮苷组、1 mg/mL根皮苷组线虫的生存时间与空白组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，0.1 mg/mL根皮苷组线虫的生存时间明显长于空白组(P<0.05)。 各组线虫生存曲线见图1。

图1 空白组和根皮苷各组线虫急性热应激条件下生存曲线

2.2寿命实验 0.05 mg/mL根皮苷组、0.1 mg/mL根皮苷组秀丽隐杆线虫的平均寿命均明显长于空白组(P均<0.05)，分别延长了12.9%和16.9%，但最长寿命与空白组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；0.2 mg/mL根皮苷组秀丽隐杆线虫的平均寿命、最长寿命与空白组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1及图2。

表1 空白组和根皮苷各组线虫寿命比较

图2 空白组和根皮苷各组线虫生存曲线

2.3应激实验 在急性热应激和百草枯氧化应激条件下，0.1 mg/mL根皮苷组线虫的生存时间均明显长于空白组(P均<0.05)，分别延长了7.5%和28.4%；0.05 mg/mL根皮苷组、0.2 mg/mL根皮苷组线虫的生存时间与空白组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。在过氧化氢应激条件下，空白组、0.05 mg/mL根皮苷组、0.1 mg/mL根皮苷组、0.2 mg/mL根皮苷组线虫的生存时间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，但0.1 mg/mL根皮苷组线虫生存时间延长了8.4%，0.2 mg/mL根皮苷组线虫的生存时间缩短了6.4%。见表2及图3。

图3 空白组和根皮苷各组线虫在不同应激条件下的生存曲线

表2 空白组和根皮苷各组线虫在不同应激调节下的生存时间比较

2.4生殖能力实验 空白组、0.05 mg/mL根皮苷组、0.1 mg/mL根皮苷组、0.2 mg/mL根皮苷组线虫几乎都在3 d内完成产卵，各组间产卵量和总产卵时间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图4。

图4 空白组和根皮苷各组线虫产卵量和总产卵时间

3 讨 论

各种压力应激是衰老的一个重要影响因素，生物个体一生各种压力积累的伤害会限制寿命，对压力的保护作用可以延长寿命[5-6]。寿命的延长与抗逆性增加密切相关。线虫是用于研究衰老和长寿的遗传学和药理学的模式生物，不仅生命周期短，易于观察，并且遗传背景清晰，其是第一个拥有完整基因序列的真核多细胞生物[7]。在有关线虫寿命的药物研究中，能延长线虫寿命的药物几乎都能提高线虫的各种抗逆性，比如紫山药、松果菊苷、地黄花多糖、鹿茸乙醇提取物等[8-11]。在研究某个药物是否能延长线虫寿命时，适宜药物浓度的确定是很重要的一环，在进行药物有效浓度初步筛选时如果进行一整个周期的寿命实验，就会使得整个实验周期很长。在一定温度范围内，环境温度的升高会增加生物个体的代谢速率，产生大量的活性氧(ROS)，ROS又能对DNA、蛋白质、生物膜等造成损伤，最终导致细胞功能障碍并增加死亡的可能性，从而导致寿命的缩短[12-13]。相对于直接进行寿命实验筛选适宜浓度，急性热应激实验的周期更短，如果能找到提高线虫抗热应激能力的根皮苷浓度，那么推测这个浓度也可以延长线虫的寿命。野生型线虫对于各种不同类型的氧化应激可能表现出不同的抗逆性[12],因此本实验采用高温应激这个更普遍的应激因素，对药物可能起延长线虫寿命作用的浓度做初步筛选,但抗逆能力和寿命不一定绝对相关，后续依然需要用寿命实验进行验证。本研究热应激筛选实验初步确定0.1 mg/mL根皮苷可以显著延长线虫急性热应激条件下的生存时间，然后在0.1 mg/mL附近设置浓度梯度进行寿命实验，结果表明0.1 mg/mL根皮苷可以显著延长线虫的平均寿命，并且可以显著延长急性热应激和百草枯氧化应激条件下线虫的生存时间。

生殖能力与寿命有联系紧密，以往多认为长寿与生殖之间有着逆向关系，即在资源有限的条件下，如果分配给生殖能力的资源多，相应的用于维持寿命的资源会减少，从而使寿命缩短。但关于影响线虫寿命的研究发现，淫羊藿总黄酮、白藜芦醇、何首乌乙酸乙酯提取物在延长野生型线虫寿命的同时，并没有降低线虫的生殖能力[14-16]。本实验结果表明，根皮苷对线虫的生殖能力没有影响，说明根皮苷不是通过影响生殖能力达到延长寿命的效果。

综上所述， 根皮苷能够提高线虫的抗应激能力延长其寿命，机制可能与增加各种抗逆性有关，并且这种延长寿命的效果不以牺牲线虫的生殖能力为代价，其延长寿命更具体的机制有待进一步研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。