刘 永， 徐建忠， 蒋 敏， 倪玲娜， 凌 扬

(苏州大学附属常州肿瘤医院肿瘤内科，江苏省常州市213032)

结直肠癌是消化系统高死亡疾病之一，其诊断多见于中晚期且转移、复发风险较高，其5年存活率不足55%[1]，故结直肠癌诊断指标及治疗靶点成为目前研究的热点。研究发现，叉头框C1(fork head boxC1，FOXC1)转录因子基因参与肝细胞癌、口腔鳞状细胞癌、乳腺癌多种肿瘤的发生发展，且FOXC1表达水平与肿瘤的不良预后息息相关[2-3]。位于FOXC1基因启动子上游的长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)转录体，简称为FOXCUT，为新发现的lncRNA，其与相邻的FOXC1蛋白编码基因相互作用，以一种“lncRNA-mRNA”基因在肿瘤发生发展中发挥着重要的作用[4]。本研究重点探析lncRNA FOXCUT和FOXC1在结直肠癌中的表达及其相关性，为结直肠癌研究提供新的线索及靶点。

1 资料和方法

1.1 一般资料

收集本院2013年1月—2017年12月75例结直肠癌原发病灶组织标本及配对癌旁正常组织标本，术前未开展放射或化学治疗，样本新鲜取材置于-80 ℃环境冻存。本研究样本使用均遵循伦理学规范，报医院医学理论委员会批准，患者知情同意，临床资料齐全，病理学确诊符合结直肠癌诊断标准[5]，均为腺癌(管状腺癌68例，黏液腺癌7例)。

1.2 免疫组织化学法

样本组织石蜡包埋，经切片脱蜡水化；消除内源性过氧化物酶活性，3次PBS冲洗，采用EDTA(pH9.0)，微波抗原修复，DAB显色，苏木精复染，常规脱水、透明、干燥、封片。PBS缓冲液代替一抗作阴性对照，以在预实验中已反复证实的FOXC1棕黄色颗粒显色作阳性对照，Image Pro Plus图像分析。

1.3 Western blot

取组织细胞总蛋白SDS-PAGE电泳，100 V冰浴转膜50 min，将蛋白转移到PVDF膜上，TBST缓冲液配制的封闭液中封闭，TBST洗涤，ECL曝光、定影，Quantity one软件显色分析。

1.4 Real Time PCR

Trizol法进行总RNA提取，根据TaKaRa反转录试剂盒操作说明，将RNA反转录成cDNA，FOXC1引物设计：Forward 5′-GGCGAGCAGAGCTACTACC-3′，Reverse 5′-TGCGAGTACACGCTCATGG-3′；FOXCUT引物设计：Forward 5′-GTCGCACCGATGACTAACG-3′，Reverse 5′-GCCCTGAAAGCCGAACTG-3′，PCR仪进行扩增荧光定量检测，PCR反应条件：95 ℃预孵育60 s、95 ℃扩增10 s,45个循环，60 ℃ 30 s，65 ℃溶解曲线，基于β-actin内参，以2-△△Ct法计算mRNA表达量。

1.5 siRNA转染细胞后的RNAi实验

选用X-Tregen介导siRNA的转染，按照X-Tregen转染试剂盒说明操作siRNA转染细胞，FOXC1 siRNA序列：Forward 5′-RCRCRARGRARURARARCRARCR GRURARARGRURURURCRURURCTT-3′，Reverse 5′-TGCGAGTACACGCTCATGG-3′；FOXCUT引物设计：Forward 5′-RARARGRARARGRARARARCRURURARCR GRURGRURURARURCRURGRGRARG-3′；FOXCUT siRNA序列：Forward 5′-RGRARARURGRGRARGRARA RCRURARARGRARCRARARURURARUCT-3′，Reverse 5′-RARGRARURARARURURGRURCRURURARGRU RURCRURCRCRARURURCRGRG-3′。37 ℃、5%CO2环境，10 mL DMEM培养基进行细胞培养，备制FOXCUT、FOXC1细胞悬液，SW480细胞传代生长至对数期时PBS冲洗、消化、重悬细胞至5×104个/mL，接种于6孔板(20 μL/孔)，并在6孔板中加入3 mL DMEM底液，每组重复2孔。待细胞融合达70%，转染24 h后取NC siRNA、FOXCUT siRNA、FOXC1 siRNA组SW480细胞，采用移液枪头(1 mm直径)进行划痕观察，并分别采集24 h与48 h图像。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 两组lncRNA FOXCUT表达水平的比较

lncRNA FOXCUT高表达率结直肠癌组织为82.67%(62/75)，癌旁正常组织为14.67%(11/75)，结直肠癌组织高于癌旁正常组织(P<0.05)。

2.2 lncRNA FOXCUT表达与结直肠癌患者病理特征的关系

lncRNA FOXCUT表达与结直肠癌患者TNM分期、AJCC分期、分化程度、远端转移、淋巴结转移等病理特征相关(P<0.05；表1)。

表1 lncRNA FOXCUT表达与结直肠癌患者病理特征的关系 单位：例(%)

2.3 两组FOXC1、FOXCUT表达水平的比较

结直肠癌组织FOXC1蛋白表达水平高于癌旁正常组织(P<0.05；图1)。siRNA转染细胞发现，结直肠癌组织FOXCUT siRNA和FOXC1 siRNA表达水平均明显低于癌旁正常组织；结直肠癌组织FOXC1 mRNA、FOXCUT mRNA表达水平高于癌旁正常组织(P<0.05；表2)。

图1 两组FOXC1蛋白表达水平的比较

表2 siRNA转染检测结直肠癌组织FOXC1、FOXCUT mRNA的表达水平(n=75)

2.4 FOXC1与FOXCUT mRNA表达相关性分析

经相关性分析，结直肠癌组织FOXC1 mRNA表达与FOXCUT mRNA表达呈正相关(图2)。

图2 FOXC1 mRNA与FOXCUT mRNA表达的相关性

3 讨 论

结直肠癌属临床常见消化道恶性肿瘤，且为消化道癌症致死第二位[6]。近年来临床对于结直肠癌的治疗技术与策略不断革新，但结直肠癌5年存活率并无明显改善，依旧有30.5%～61.7%患者发生转移或复发[7-8]。因此积极探寻结直肠癌诊治的靶向分子标志物，研究结直肠癌的发生发展机制成为业界关注热点。

有研究发现，FOXC1表达异常与恶性肿瘤发生及病情进展密切相关，如上调FOXC1表达可造成卵巢癌细胞增殖活性反应，而FOXC1表达降低可预测前列腺癌侵袭进展及不良预后[9]。本研究结果表明，结直肠癌组织FOXC1表达高于癌旁正常组织，表明FOXC1参与结直肠癌肿瘤浸润、转移发展。推测FOXC1通过上皮间质化(EMT)、细胞信号转导，促进肿瘤血管生成途径等影响肿瘤细胞的生长和增殖而参与到各种肿瘤的发生和发展过程，与冯晋等[10]研究一致。

近年对lncRNA的研究不断深入，lncRNA在肿瘤的发生、发展过程中发挥着促癌及抑癌作用，参与了细胞凋亡、侵袭与转移等过程，在转录调控、转录后调控及表观遗传学调控层面发挥着重要的作用[11-12]。本研究结果中，结直肠癌组织lncRNA FOXCUT高表达率为82.67%，高于癌旁正常组织，且lncRNA FOXCUT高表达与患者TNM分期、AJCC分期、高分化等病理特征明显相关(P<0.05)，提示lncRNA FOXCUT高表达的结直肠癌细胞具有较强的细胞增殖功能，同时远端转移、淋巴结转移率较高，推测lncRNA FOXCUT高表达可促进癌细胞侵袭功能，增加远端转移风险，表明lncRNA FOXCUT在结直肠癌肿瘤发生发展中有促癌基因的效应。

lncRNA复杂多样，但是其对基因的调控方式却很相似，有规律可循，在表达或功能调节上，lncRNA之间及其与临近的mRNA之间存在着某种关联，很大比例的lncRNA与相邻的mRNA基因相互作用[13]，“lncRNA-mRNA”基因是调控疾病的表观遗传学中一种新的模式。本研究通过相关性分析可知，结直肠癌组织FOXC1 mRNA与FOXCUT mRNA表达呈正相关，推测FOXC1为FOXCUT靶基因，可基于“lncRNA-mRNA”基因遗传学相关原则促进结直肠癌肿瘤进展，能够以FOXCUT-FOXC1基因模式调控肿瘤进程。

综上所述，FOXC1与FOXCUT在结直肠癌细胞中呈高表达，且FOXC1 mRNA与FOXCUT mRNA表达呈正相关性，存在相互作用调控肿瘤细胞增殖及侵袭的作用。