郭丽丽，王东阳 ，朱坤龙 ，魏宇豪，李树伟,*

（1塔里木大学生命科学与技术学院，新疆 阿拉尔 843300）

（2塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

皮肤是哺乳动物最大的器官之一［1］，毛囊是皮肤衍生物。毛囊具有独特的立体空间结构及周期性的再生功能，静止状态的毛囊细胞在皮肤出现损伤后，表现出迅速增殖和多向分化的潜能，迅速修复坏死损伤的表皮、毛囊、皮脂腺等，而具体行使修复功能的细胞及调控机制研究尚且不清楚［2］。毛囊是皮肤附属器之一，是哺乳动物成体中最重要的且处于不断再生状态的器官之一，循环经历着生长期、退行期和休止期［3］。毛囊的生长发育分期，对研究毛囊生长发育具有重要意义［4］。毛囊属于哺乳动物皮肤的重要结构和功能亚器官［5］，具有独特的可再生能力和高度的自我更新能力，毛囊细胞经增殖分化成熟后最终形成毛发。不同动物的毛囊形态各有不同，但都具有毛球、毛干、内根鞘、外根鞘等基本结构［6］。国内外对胚胎小鼠的毛囊［7］及出生后不同肢体部位的毛囊，从形态学及发育周期做了相关的研究［8］，而对出生后小鼠在不同生长时期毛囊发育变化规律的研究较少，对随着小鼠生长周期变化，毛囊生长发育周期差异缺乏深入研究，对随着小鼠年龄的增加，毛囊、毛干生长发育发生巨大变化的研究目前尚不清楚。

本研究通过组织切片技术对小鼠出生后第1～12 d背部皮肤组织结构特征进行观察。利用新生同一窝小鼠生长发育的同时性、同步性，通过组织切片技术观察其背部毛发变化并进行组织形态学差异分析，研究新生小鼠背部皮肤毛发随年龄增加，毛干及毛囊生长发育出现的变化规律。为进一步探索皮肤毛囊发育差异及其调控机制提供一定的试验参考，同时通过观察毛囊发育的规律，为后期研究药物对毛囊发育的影响及创面愈合修复皮肤毛囊再生的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 小鼠毛囊样品采集

选取妊娠晚期雌性昆明小鼠6只，来源于塔里木大学动物科学与技术学院实训基地。分笼单独饲养，分娩后开始随机采集5只新生小鼠背部皮肤样本，后期于同一时间点处死5只小鼠，将分别采集出生后第1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d、10 d、11 d、12 d小鼠的背部皮肤组织样本，一部分保存至-80℃冰箱备用，另一部分保存至液氮罐中备用。

1.1.2 主要试剂与仪器

试验仪器：LEICA S6E解剖显微镜（德国LEICA公司），MODEL Ckx41SF倒置显微镜（日本Olympus公司），LEICA组织摊片拷片机（德国LEICA公司），HODIIBOXUN超净工作台上（上海博讯实业有限公司医疗设备厂），LEICA冰冻切片机（德国LEICA公司），麦克奥迪可视化显微镜（厦门麦克奥迪医疗诊断有限公司）。

试验试剂：OCT冰冻包埋剂，购自美国Gibco公司；苏木精、伊红，购自武汉赛维尔生物科技有限公司；多聚甲醛（PFA）、无水乙醇等生化常规试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 获取标本及保存方法

新生小鼠，1～12 d每日采样，采用颈椎脱臼法处死新生小鼠，操作过程中严格遵循动物伦理保护法，将小鼠于75%乙醇溶液消毒60 s，随即转移至超净工作台中，剃毛后利用显微外科剪分离新生小鼠背部皮肤，切成8 mm×8 mm皮片，并将游离皮片转移至超净工作台上。OCT组织包埋，一部分皮片紧贴包埋盒侧壁，用镊子移动皮片至包埋盒中央并与底面垂直，编号记录纵切皮片，最后将包埋样本转移至-80℃冰箱冷冻24 h备用。取出冰冻OCT组织包埋样本并使用德国徕卡切片机，制作15µm厚度的毛囊纵向组织切片。一部分皮片紧贴包埋盒底面，用镊子移动皮片至包埋盒中央并与底面平行，编号记录横切皮片，最后将包埋样本转移至-80℃冰箱冷冻24 h备用。取出冰冻OCT组织包埋样本并使用德国徕卡切片机，制作15µm厚度的毛囊横向组织切片。

1.2.2 HE常规染色

将保存于-80℃冰箱的纵向、横向组织切片盒取出，于组织摊片拷片机上在温度40℃条件下晾干10 min，移入染色盒内，蒸馏水浸润3 min；滴加苏木素染色5 min；蒸馏水漂洗1 min，待载玻片上多余的苏木素染液明显漂洗干净后；再移入染色盒，滴加1%盐酸乙醇分化5 s，移入清洗盒，蒸馏水漂洗1 min；再移入染色盒，滴加伊红染色30 s；移入清洗盒，蒸馏水漂洗2 min，洗净载玻片上多余的伊红染液；于50%、75%、100%的乙醇中顺浓度梯度各浸泡20 s；使用Histoclear透明剂透明6 s；移入组织切片盒，自然晾干后中性树胶封片，转移至麦克奥迪可视化显微镜观察并拍照。

2 结果与分析

2.1 新生小鼠毛发生长形态观察

观察新生昆明小鼠1～12 d皮毛生长情况，可以发现刚出生的小鼠皮肤红润，肉眼看不到皮毛，直到出生后第5 d才可以观察到小鼠背部长出细小的白色绒毛（见图1）。

小鼠出生时背部皮肤有大量的褶皱，随着日龄的增加，褶皱逐渐变浅，于7日龄褶皱消失。小鼠出生时背部皮肤为鲜红色，随着小鼠日龄的增长，皮肤颜色逐渐变浅，毛发逐渐发生变化，于5日龄可以观察到小鼠背部长出细小的白色毛发，这种变化主要是毛发密度和毛发长度的增加。

2.2 新生昆明小鼠毛囊纵切面观察

将不同日龄的小鼠皮肤样本进行纵切，HE染色，用（40×、100×、200×、400×）显微镜观察皮肤毛囊发育情况，可以发现毛囊长而直，在皮肤内斜向生长。毛球较毛干着色较深，真皮乳头较清晰，根鞘完整，毛囊的长度随着小鼠日龄的增加不断增加（见图2）。

观察毛囊切片，利用分析软件测量毛囊的深度，统计数据并进行差异显著性分析，由图3分析可知，昆明小鼠毛囊的深度随着年龄的增长而不断加深，这种随着年龄增长不断加深的趋势主要集中在出生后1～7 d，在第7 d后逐渐趋于平稳。

图3 新生昆明小鼠毛囊深度分析

2.3 新生昆明小鼠毛囊横切面观察

将不同日龄小鼠皮肤进行横切，HE染色，观察毛囊发育情况，可以发现毛囊的密度越来越大，数量不断增加（见图4）。

图4 新生昆明小鼠毛囊横切面观察

分别于新生小鼠出生后第1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d取样，每次5只小鼠，每只小鼠皮肤横切2个载玻片，进行HE染色，每个载玻片选取一个（400×）视野计数，由图5的结果可知，昆明小鼠毛囊的数量随着年龄的增长而不断增加，这种随着年龄增长毛囊数量增加的趋势主要集中在出生后1～9 d，在第9 d后逐渐趋于平稳。

图5 新生昆明小鼠毛囊计数

3 讨论

目前国内外对皮肤毛囊的生长发育分化及毛囊的生长周期有相关的研究报道［9-10］，发现有关毛囊生长发育的调控信号通路［11］。皮肤在哺乳动物的体表起保护作用，是面积最大的器官［12］，其主要包括毛囊、皮脂腺、毛干等附属结构。毛囊是一个形态和结构较为复杂的皮肤附属器官，并且具有独特的立体构象，其控制着毛发的生长，具有自我更新和周期性生长的特点。在皮肤分化发育的过程中，毛囊也按照固定的形式分阶段分化发育成熟。毛囊在生长发育过程中受多种因子的共同调控［13-14］，这些相关调控因子主要包括：激素、细胞因子、神经肽等，毛囊周期包括三个阶段：生长期、退化期、静止期，毛囊在胚胎发育过程中形成，出生后毛乳头变化较少，但是毛乳头以外的其他成分不断的循环变化［15］。

本试验通过观察发现昆明小鼠出生后1～12 d毛囊生长发育呈现出周期性变化，且处于同一生长时期的毛囊形态具有高度相似性。新生小鼠毛干及内根鞘处于比较活跃的状态，小鼠毛囊密度、长度和深度在出生后一周发生急剧变化。小鼠毛囊生长初期，主要是毛囊长度增长，生长活跃，毛乳头也随之增长，深入真皮，毛球部明显宽于毛根部；毛囊生长中期，毛囊缩短，毛乳头致密；毛囊生长末期，毛囊萎缩，其底部成棒状，毛干脱落，开始进入下一个毛囊周期，逐渐长出新毛。小鼠毛囊组织结构的变化规律及其调控机制有待进一步深入的分析研究。

综上所述，小鼠皮肤及其附属结构（毛囊）的急剧变化期发生在小鼠出生后的一周时间内，该时期具有显著的表观形态学变化。因此这个生长发育期可以作为毛囊及皮肤研究的最佳时期。毛囊及皮肤相关蛋白表达与发育成熟后的个体可能存在巨大的差异，并且毛囊及皮肤相关基因在转录水平与发育成熟后的个体可能同样存在巨大的差异。本试验的研究成果，可以为皮肤及毛囊的进一步深入研究提供理论参考。