陈金媛，范芳娟，靳梦楠，李 丁

（湖南工业大学生命科学与化学学院，湖南 株洲 412007）

当前，工农业技术越来越先进，但技术发展的同时也带来了许多负面影响。例如，越来越多的土壤受到重金属等的污染，尤其是水稻农田的重金属污染问题引起了民众的广泛关注。水稻是我国大部分地区的主要粮食作物，土壤中的重金属通过水稻制品进入食物链，导致Cd、As 等重金属大量在人体中积累，对人体健康造成极大危害。研究表明，人体Cd 中毒将导致骨质疏松症、癌症[1]，As 中毒会诱导神经系统并发症、癌症[2-3]等。因此，探究重金属污染的水稻农田修复以及安全利用具有重要的现实意义。

铁锰膜（iron manganese plaque，IP）是附着在湿地植物根系表面的一层铁锰氧化胶膜，具有阻隔植物吸收污染物的作用[4]。生长在淹水环境中的湿地植物向根际运输并释放氧气，维持植物的正常呼吸，同时，多余的氧气可将环境中的Fe2+和Mn2+氧化并沉淀为包裹根面的铁锰斑，最终形成铁锰膜[5]。由于具有吸附功能的基团，铁锰膜可以吸附或共沉淀金属离子，并作为“屏障”减少植物对Pb、Cu、Ni、Hg 和Sb等金属的吸收[6-7]，还可以改变植物体内As、Cd 和Se 的转运[8]。还有研究表明，因为对金属离子具有较强的吸附性，铁锰膜可用作缓冲剂，降低As 在水中的溶解度[9]。

铁锰膜的形成受土壤理化性质、水分管理、根际氧化物质以及铁锰氧化菌和铁锰还原菌等[10-11]多种因素的影响。其中，铁锰氧化菌是一类能够促进铁、锰氧化形成铁、锰氧化物的微生物。已有研究表明，铁锰氧化菌能够促进植物根系铁锰膜的形成。Providenciasp. LLDRA6 是一株分离自湖南省株洲市清水塘某冶炼厂周边土壤的细菌，前期已通过基础试验证明菌株具有锰氧化能力和铁氧化能力[12]。笔者拟通过水培试验初步探究该菌株对铁锰膜形成以及Cd 在水稻植株体中转运的影响，为该菌株的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌 种供试菌株为土壤细菌Providenciasp.LLDRA6（CCTCC 保藏编号：M2018876），分离自湖南省株洲市清水塘某冶炼厂周边的土壤，前期已通过基础试验证明菌株LLDRA6 具有锰氧化能力和铁氧化能力。

1.1.2 培养基（1）LB 培养基：酵母浸粉5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，氯化钠5.0 g，超纯水1 000 mL，pH值 7.0（固体培养基加18.0 g 琼脂）。（2）水稻营养液组分：NH4NO391.4 mg/L、NaH2PO4·2H2O 32.14 mg/L、K2SO471.4 mg/L、CaCl288.6 mg/L、MgSO4158.22 mg/L、MnCl2·4H2O 1.5 mg/L、(NH4)6Mo7O24·2H2O 0.074 mg/L、H3BO30.934 mg/L、ZnSO4·7H2O 0.035 mg/L、CuSO4·5H2O 0.031 mg/L、FeCl34.62 mg/L、Citric acid monohydrate 11.9 mg/L。

1.1.3 供试水稻供试水稻品种为华占和台北309，水稻种子来自湖南杂交水稻研究中心。种子消毒后催芽，选取长势均匀的幼苗移栽。

1.2 试验方法

1.2.1 溶液配置（1）菌株悬浮液：将供试菌株接种至LB 液体培养基中于35℃的恒温摇床中180 r/min 培养16 h 后，6 000 r/min 离心10～15 min 收集菌体，并重悬于同等体积无菌去离子水中制成悬浮液备用。（2）DCB 提取液：称取88.23 g Na3C6H5O7·2H2O 和10.48 g NaHCO3，去离子水充分溶解后，定容至1 L 容量瓶中，Na3C6H5O7·2H2O浓度为0.3 mol/L，NaHCO3浓度为0.125 mol/L。

1.2.2 试验设计水稻发芽后，选取长势均匀的水稻幼苗，分栽至黑色避光水稻盆中（每盆1 L 营养液）。试验设置5 个处理，每个处理3 个平行，分别为：处理1（CK），空白对照；处理2，菌株悬浮液+Fe2+（Fe2+浓度为5 mmol/L，菌株悬浮液添加量为30%）；处理3，H2O+Fe2+（Fe2+浓度为5 mmol/L）；处理4，菌株悬浮液+Mn2+（Mn2+浓度为1 mmol/L，菌株悬浮液添加量为30%）；处理5：H2O+Mn2+（Mn2+浓度为1 mmol/L）。每星期换2 次营养液，生长1 周后检测根系DCB-Fe和DCB-Mn 含量；然后在营养液中添加Cd2+（Cd2+浓度1 mg/L），继续生长1 周后，收集茎叶部分样品进行检测。

1.2.3 DCB 法检测根系铁锰膜含量水稻根系表面铁锰膜含量的检测方法为DCB（dithionite-citratebicarbonate）提取法。随机选取不同盆栽水稻根系，洗净后自然晾干水分，置于盛有30 mL DCB 提取液和0.5 g 保险粉的锥形瓶中，室温下浸提1 h。浸提液过0.25 μL 针孔式水系滤膜，滤液于4℃冰箱保存，Fe、Mn含量采用原子火焰吸收仪测定。

1.2.4 酶活性的检测方法与步骤：按所用试剂盒（POD、SOD）说明书进行操作。具体内容如下：将收集的新鲜水稻根系组织剪碎，称量约0.1 g 放入玻璃匀浆器中，加入提取液1 mL，冰浴中进行匀浆；待样本完全研碎后，将匀浆转移至1.5 mL 离心管；4℃，12 000 r/min 离心10 min，收集上清液，按照试剂盒说明书进行后续操作，计算不同处理下水稻根系POD和SOD 酶活性。

1.2.5 茎叶部分镉含量将所有水培水稻茎叶部位的样品分别装入纸袋，65℃下干燥72 h，烘干至恒重后研磨成粉，送湖南杂交水稻研究中心检测样品中的Cd 含量。

1.3 数据处理

试验数据采用Microsoft Excel 2003、Origin 8.5.0等进行处理分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理对水培水稻根系外观的影响

水稻种子消毒浸泡发芽，选取长势均匀的水稻幼苗，分栽至黑色避光水稻盆中适应生长，1 周后进行处理。处理后又生长了1 周的水稻根系如图1 所示。经悬浮液+Fe2+处理后，2 个水稻品种的根系均呈现明显的红色，且颜色比H2O+Fe2+处理组更深。由此推测，LLDRA6 菌株可能会促进水稻根系表面形成较厚的铁锰膜。

图1 不同处理下水培水稻根系的外观

2.2 不同处理对水稻根系POD 和SOD 酶活性的影响

由图2 可知，台北309 品种的根系POD 酶活性显著高于华占的；2 个水稻品种处理2～5 的POD 酶活性高于处理1（CK）。华占品种中，处理2（悬浮液+Fe2+）和处理4（悬浮液+Mn2+）的POD 酶活性略高于其他处理组；台北309 品种中，处理3（H2O+Fe2+）和处理4（悬浮液+Mn2+）的POD 酶活性显著高于其他处理组。华占与台北309的SOD酶活性无明显差异，处理后的水稻根系SOD 酶活性显著高于CK，且2 个品种均以处理3（H2O+Fe2+）的SOD 酶活性最高。总体来看，菌株悬浮液和Fe2+、Mn2+溶液处理，可以增高水稻根系的POD 酶和SOD 酶活性。由于SOD 酶可以清除植株的自由基，而POD 酶在植物的抗逆性中起重要作用。因此，上述溶液处理可以增强水稻的抗逆及防御系统，提高水稻对环境的适应性。

图2 不同处理下2 个品种水稻根系的POD 和SOD 酶活性

2.3 不同处理对水稻根系铁锰膜含量的影响

由表1 可知，华占品种中，处理2 的DCB-Fe 含量最高，处理4 的DCB-Mn 和DCB-Cd 含量最高。台北309 品种中，处理2～5 的DCB-Fe 含量均高于处理1（CK），其中处理2 的DCB-Fe 含量最高；处理5 的DCB-Mn 含量高于其他处理，处理4 次之；处理2 的DCB-Cd 含量高于其他处理。产生这样结果的原因可能是铁锰氧化菌LLDRA6 促进了Fe2+、Mn2+氧化形成致密的铁锰膜附着在根表面，而铁锰膜上又吸附了大量的Cd 元素阻止Cd 元素继续向水稻茎叶部分运输。

表1 不同处理下2 个品种水稻根系表面的元素含量

2.4 不同处理对水稻茎叶部分镉含量的影响

如图3 所示，2 个水稻品种处理2～5 的茎叶部分Cd 含量均显著低于处理1（CK）。其中，华占品种中，处理2 的Cd 含量最低，其次是处理3，二者的Cd 含量均远低于处理4～5；而台北309 品种中，处理3 的镉含量最低，其次是处理2，二者的Cd 含量均远低于处理4～5。由此推测，菌株LLDRA6 和Fe2+溶液诱导铁锰膜形成的效果强于LLDRA6 和Mn2+溶液。然而，铁锰膜的形成受诸多因素的影响，不同水稻品种间存在差异。

图3 不同处理下2 个品种水稻茎叶部分的Cd 含量

3 结论与讨论

在盆栽水培条件下，用铁锰氧化菌菌悬液和Fe2+、Mn2+溶液处理水稻幼苗，1 周后，菌株悬浮液+Fe2+处理的2 个水稻品种的根系均呈现明显的红色，说明菌株LLDRA6 悬浮液可促进水稻根系表面形成铁膜；DCB 法结果也证实了这一点，菌株悬浮液+Fe2+处理的水稻根系表面DCB-Fe 含量显著高于其他处理；根系酶活检测结果显示，经Fe2+和Mn2+处理后，水稻根系的POD 酶和SOD 酶的活性高于空白对照组；经Fe2+处理后，2 个水稻品种茎叶部分的Cd 含量显著低于其他处理组。由此推测，菌株LLDRA6 可促进水稻根系表面铁锰膜的形成，对Cd 在水稻植株中的迁移具有显著的阻隔效果。

大米一直被认为是人体Cd 摄入的主要途径之一[13]。水稻根系表面铁锰膜的形成主要受土壤氧化以及还原体系中Fe、Mn 在水稻根表的还原溶解和氧化成矿情况影响。锰在金属从水稻土到植株根部的运输中起着至关重要的作用[14]。然而，铁锰膜的形成是一个动态的过程，在不同环境以及不同植物及其生长不同时期均有明显的差异。此外，水稻对Cd 的吸收还受土壤中Cd 的有效性以及根际环境的影响。其中，Cd 的有效性主要由Cd2+的形态决定。而根际环境主要受根系生长的物理力、根系分泌物以及根际微生物的影响[15-16]。这可能是导致根际土壤中Cd 的流动性、生物有效性和归趋独特性的主要原因[17]。

目前，关于铁锰膜对水稻吸收污染物影响的研究已有较多报道。例如，有研究称，IP 对水生植物吸收和摄取抗生素的影响主要表现在其可以阻止抗生素在植物体内的吸收和转运。Tang 等[18]的研究表明，四环素类药物（TCs）在根面的吸附量与IP 量呈正相关，TCs 的转运因子也与IP 含量呈良好的负线性关系。当多环芳烃和多溴联苯醚在淹水状态下暴露于2 种红树植物的根部时，根部形成的IP 起到了“屏障”的作用，阻止了污染物进入植物[19]。还有研究显示，具有发达根系且能够形成铁锰膜的水生植物常用于修复受污染的水体。

笔者的研究证明了菌株LLDRA6 能够促进水稻根际表面铁锰膜的形成，铁锰膜又可以有效阻隔水稻对Cd 元素的吸收和转运，同时可以通过增强POD 和SOD 酶活性来提高水稻的抗逆性。然而，该研究是基于溶液水平完成的，植株根系所处环境与真实的水稻生长环境有较大差异。因此，后续将开展土壤盆栽试验以及大田试验进行进一步验证。