肖勇 贺海东 胡屏 孙蔚倩 徐旭东 唐余燕

以呼吸道或消化道感染后出现肉眼血尿为特征的免疫球蛋白A（IgA）肾病（IgAN），是最常见的原发性肾小球肾炎，常见于20～40岁的年轻人。并且20%～40%的IgAN患者会在发病20年内进展为终末期肾病[1]。尽管人们对IgA肾病的发病机制有了更深入的了解，治疗方法也有所改进，但IgAN仍然是导致终末期肾病的主要原因。目前，IgAN的诊断只能通过有创性肾活检病理检查来确诊。此外，其相应的治疗主要依赖于肾素-血管紧张素系统（RAS）的非特异性抑制剂和免疫抑制剂，但治疗效果不理想。

IgAN病理特征在于半乳糖缺陷型IgA1（GdgA1）广泛沉积于肾小球系膜，然而含有lgA的沉积物的增殖和最终导致肾小球损伤的确切机制尚不清楚。据报道，与健康对照组相比，IgAN患者的血清IgA和Gd-IgA1水平升高[2]。IgA1的不完全糖基化也被证明为进一步起到自身抗原的作用，诱导产生自身抗体[3]。在IgA受体的协助下，这些含有Gd-IgA1的免疫复合物（IC）在肾小球系膜沉积，导致细胞增殖和细胞外基质、细胞因子和趋化因子的过度产生，从而导致肾小球损伤[4]。然而，关于IgAN的病因和发病机制仍存在一些争议。有研究表明，选择性IgA1的高应答性在IgAN的发病机制中起重要作用。

然而，Gd-IgA1的准确表达位置仍然存在争议。最近的研究表明，肠道微生物群的改变对宿主免疫反应具有很大影响，会导致自身免疫性疾病的发生或进展[5]。先天免疫系统和获得性免疫系统分别在宿主和肠道微生物群之间形成生化屏障。然而，在屏障被打破的情况下，可能会发生菌群失调，导致严重的炎症反应。同时，肠道微生物的改变可增加抗原载量和上皮TLR的识别性，从而促进B细胞的类型转换和IgA的过度产生[5]。这意味着稳定微生物可能会转变为肠道菌群失调，包括非主要菌群或潜在有害细菌的过度生长[6]。持续的抗原侵袭也可能导致肠道通透性、亚临床炎症状态或黏膜相关淋巴组织激活的改变[7]。我们前期研究表明IgAN患者血清Gd-IgA1水平较正常组及疾病对照组升高，与患者的24 h尿蛋白定量、肾脏损伤程度呈正相关[8]。因此本研究旨在探讨肠黏膜屏障功能与血清Gd-IgA1表达水平的相关性，为临床指导IgAN的诊断与治疗提供新的思路。

对象与方法

1 对象 前瞻性收集2019年1月～2019年12月我科住院病人，入选标准：（1）首次经我科肾活检病理证实为IgAN患者，45例作为实验组；（2）年龄≥18岁，既往未接受糖皮质激素、免疫抑制剂或肾移植治疗；（3）排除合并感染、肿瘤、妊娠等情况；肾小球滤过率（eGFR）均≥50 mL·min-1·（1.73 m2）-1。我院体检中心正常健康对照组25例。所有标本均已获得受试者知情同意，并得到闵行区中心医院伦理委员会的批准（批件号：2018-010-01K）。收集上述两组外周血5 mL，离心并收集血清，检测所有血清样本中肠黏膜屏障损伤指标（细胞黏附分子（ICAM）、D-乳酸（D-LAC）、脂多糖（LPS）、二胺氧化酶（DAO））、炎症因子（白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α））及Gd-IgA1水平，同时收集患者的一般资料及临床指标（肾功能、24 h尿蛋白定量及IgA水平），并将上述指标进行统计学分析。

2 方法

2.1 主要试剂：患者肾功能、24 h尿蛋白定量、IgA水平为患者住院期间本院检验科检测，同时使用人半乳糖缺乏IgA1（Gd-IgA1）特异性抗体KM55酶联免疫（ELISA）检测试剂盒检测血清Gd-IgA1，购自日本IBL公司，批号（Lot No）2E-117，货号（Code No）27600。DAO（cat. no. SDH0135）、D-LAC（cat. no. SDH0134）、sICAM-1（cat. no. SDH0131）及 LPS（cat. no. SDH0133） 、TNF-α（cat. no. SDH0001）及IL-6 （cat. no. SDH0021）ELISA检测试剂盒均购置上海司鼎生物科技有限公司。

2.2 收集标本：所有慢性肾炎患者，活检当日清晨空腹采血5 mL，即时分离血清，吸入1.5 mL EP管，分装3管，贴好标签，放入-80℃冰箱保存备用。登记患者信息，确诊IgAN的患者取出标本用于后续试验。

2.3 ELISA检测：样本为上述制备的外周血血清；依据试剂盒说明书检测。

2.4 相关性分析：通过pearson相关性分析对IgAN患者肠黏膜屏障损伤指标（DAO、D-LAC、sICAM-1及 LPS）与血清Gd-IgA1水平进行统计分析。

3 统计学处理 采用Graph Pad Prism5.0及SPSS 22.0软件进行作图和统计分析。非正态分布计量资料以中位数（最小值-最大值）表示，正态分布计量资料以均数±标准差（mean±SD）表示。两组间比较采用t检验，性别分布分析采用χ2检验，相关性分析采用pearson分析方法。P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 两组的一般资料 两组在性别比例及年龄组成上差异无统计学意义（P＞0.05），而与对照组相比，IgA肾病组血清肌酐（Scr）及Gd-IgA1水平升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1 。

表1 实验组及对照组的一般资料

2 两组血清Gd-IgA1水平比较 根据文献，采用KM55 ELISA试剂盒检测两组血清样本Gd-IgA1水平[9]，与对照组（3.81±1.03）mg/L相比，IgAN患者Gd-IgA1（9.36±3.43）mg/L水平明显升高，差异具有统计学意义（t=6.94，P＜0.000 1），见图1。

图1 两组血清Gd-IgA1水平比较

3 两组血清炎症因子水平比较 为了探讨IgA肾病患者Gd-IgA1水平升高机制，我们进一步采用ELISA试剂盒，检测两组血清样本炎症因子（IL-6及TNF-α）水平，结果发现，IgAN患者TNF-α（242.6±167.1）pg/mL水平比对照组（116.9±32.81）pg/mL升高，同时，IgAN患者组IL-6（44.13±24.47）pg/mL比对照组 （30.16±12.46） pg/mL水平升高，差异均具有统计学意义（t=2.78，P=0.007 3；t=2.30，P=0.027），见图2。提示IgAN患者处于微炎症状态。

图2 两组血清炎症因子水平比较

4 两组肠黏膜屏障损伤指标水平比较 为了探讨IgAN患者微炎症状态及Gd-IgA1产生机制，我们检测了IgAN患者外周血清肠黏膜屏障损伤指标（DAO、D-LAC、sICAM-1及 LPS）水平，与对照组相比（186.1±33.35）U/mL ，IgAN患者DAO（230±65.16）U/mL表达水平升高（t=2.527，P=0.015）；IgAN患者D-LAC（0.67±0.45）mmol/L水平也比对照组（0.45±0.09）mmol/L高（t=2.152，P=0.035）；并且IgAN患者sICAM-1表达水平（1 052±154.4）ng/mL比对照组（822.5±96.23）ng/mL升高（t=6.025，P＜0.0001）；LPS水平与对照组相比（1 357±330）pg/mL，IgAN患者（1 567±377）表达升高（t=2.045，P=0.045），见图3。提示IgAN患者肠道黏膜屏障功能受损，与IgAN患者微炎症状态及Gd-IgA1产生增多相关。

图3 两组肠黏膜屏障损伤指标水平比较

5 血清Gd-IgA1与肠黏膜屏障损伤指标的关系 为了进一步分析Gd-IgA1产生机制，通过相关性分析IgAN患者血清Gd-IgA1水平及肠黏膜屏障损伤指标（DAO、D-LAC、sICAM-1及 LPS）水平，结果发现IgAN患者Gd-IgA1水平与肠道屏障损伤指标呈正相关（P＜0.05），见图4，提示Gd-IgA1表达水平与肠道屏障功能受损相关。

图4 血清Gd-IgA1与肠黏膜屏障损伤指标的关系

讨 论

肠道微生物及其衍生代谢物已被认为对免疫稳态有重大影响[10]。据估计，肠道内有多达100万亿个微生物[11]。这些肠道微生物维持上皮屏障的完整性，塑造了肠道免疫系统，通过微生物代谢物、组成和对宿主细胞的附着来平衡宿主防御[12]。同时，肠黏膜包含大量不同的免疫细胞，它们参与维持健康的肠道微生物，并增强上皮屏障功能[13]。越来越多的证据支持肠道微生物群在宿主免疫反应中作为关键调节元件的重要作用。已知肠上皮细胞能够表达不同的模式识别受体，如Toll样受体（TLR）和NOD样受体（NLR），用于免疫监测。研究表明，它们能感知细菌成分，诱导信号转导，促进上皮细胞增殖，促进肠上皮细胞释放细胞因子、抗菌肽和粘液[14]。例如，已观察到革兰氏阴性细菌的外膜脂多糖（LPS）在培养的IgAN外周血B淋巴细胞中具有激活TLR4的能力。LPS显示出强烈抑制核心β1，3半乳糖转移酶特异性分子伴侣（Cosmc）mRNA的表达，导致聚合Gd-IgA1的过度产生[14]。来自侵袭性病原体的鞭毛蛋白被认为是通过肠道固有层中TLR-5+CD11+的树突状细胞诱导促炎细胞因子，导致小鼠IgA升高[15]。尿毒症毒素，如吲哚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、吲哚-3乙酸、三甲胺N-氧化物和苯乙酰谷氨酰胺，也被发现能够促进肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ、白细胞介素-1β和白细胞介素-12的释放，导致肠道炎症和免疫球蛋白A的过度产生。硫酸吲哚通过干扰素调节因子（IRF1）-线粒体动力相关蛋白1（DRP1）（IRF1-DRP1）轴介导的线粒体吞噬功能损伤来诱导肠屏障损伤。降低吲哚硫酸浓度或针对IRF1-DRP1轴可能是缓解慢性肾脏疾病相关肠道功能障碍的有前景的治疗策略[16]。

肠黏膜屏障功能在慢性肾脏病发生及发展中的作用日益受到人们的重视。肠道微生物群的改变可能会影响全身或局部免疫反应。正常情况下，宿主给微生物提供了一个平衡的免疫系统，宿主和肠道微生物群保持动态平衡。先天免疫系统和获得性免疫系统分别在宿主和肠道微生物群之间形成生化屏障。然而，在屏障被打破的情况下，可能会发生菌群失调，导致严重的炎症反应。异常的免疫反应已被证明会导致炎症细胞的浸润增加，如中性粒细胞、树突状细胞、Th1或Th17细胞[17]。同时，肠道微生物的改变可增加抗原载量和上皮TLR的识别性，从而促进B细胞的分类转换和IgA的过度产生[18]。因此肠道黏膜屏障功能受损可能参与Gd-IgA1产生。

我们可以通过评估IgAN患者肠道黏膜屏障功能来研究Gd-IgA1产生机制，而检测肠道屏障功能的状况是诊断肠道屏障功能受损的重要依据。但目前直接观察肠道屏障功能仍较困难，多通过检测细胞黏附分子（ICAM）、D-乳酸（D-LAC）、LPS、二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）间接反映肠黏膜的屏障功能。DAO是肠黏膜上层绒毛细胞胞浆中具有高度活性的细胞内酶，当肠黏膜上皮细胞受到损伤后，胞内释放DAO增加，进入肠细胞间隙、淋巴管和血流，使血浆DAO升高，外周血中DAO活性稳定。因此，血DAO活性可反映肠道损伤和修复情况[19]。D-乳酸是胃肠道固有细菌的代谢终产物，肠道多种细菌均可产生。因哺乳动物体内不具备将其快速代谢分解的酶系统，在肠黏膜受损和肠黏膜通透性增加时，肠道中细菌产生的D-乳酸通过受损肠黏膜经循环入血，可见血中D-乳酸水平升高。因此检测其外周血水平即可反映肠道损伤和修复情况[20]。白细胞的过度激活是炎症性肠病病理过程中的一个重要环节。白细胞停滞并浸润式的血管外渗依赖于炎症部位白细胞和内皮细胞膜表面的黏附分子（intercellular adhesion molecule ICAM）的表达与功能。其中ICAM-1 属于免疫球蛋白超家族，在炎症性肠病发病中的作用近年来受到关注。正常肠组织ICAM-1 通常低水平表达于血管内皮细胞、肠黏膜固有层和淋巴结中的单核巨噬细胞。在IBD肠组织中，I-CAM-1 表达和分布明显增加，且与组织的炎症程度密切相关[21-22]。因此，检测血清sICAM-l 的水平可能成为监测肠道黏膜功能状态的重要指标[23]。

本研究通过对45例IgAN患者及健康组25例进行血清炎症因子，可溶性细胞间黏附分子-l （sICAM-1），D-乳酸（D-LAC）、DAO和LPS定量测定，评价其在IgAN患者中的变化及其临床意义。结果发现IgA肾脏患者外周血清炎症因子（TNF-α及IL-6）较对照组升高，肠黏膜屏障损伤指标（D-LAC 、DAO、sICAM-1及 LPS）水平也较对照组升高，提示IgAN患者肠道黏膜屏障功能受损。我们前期研究表明IgAN患者血清Gd-IgA1水平较正常组及疾病对照组升高，与患者的24 h尿蛋白定量、肾脏损伤程度呈正相关[8]。因此我们进一步分析肠黏膜屏障损伤指标与Gd-IgA1水平相关性，结果表明D-LAC 、DAO、sICAM-1及 LPS水平与Gd-IgA1水平呈正相关，提示肠道屏障功能受损，导致炎症反应，从而诱导Gd-IgA1产生增多，最终导致肾小球系膜区IgA1沉积及肾炎发生。

综上所述，本实验证实了IgAN患者Gd-IgA1及炎症因子表达升高，可能与IgAN患者肠道黏膜屏障受损相关，这为改善IgAN的治疗监测及判断预后开拓新方向。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突