刘新荣 刘永华 楚蔚琳

青岛市市立医院(266000)

卵巢癌在女性生殖系统肿瘤中死亡率高，目前治疗方法以手术后化疗最为常见，而化疗药品中紫杉醇应用较为广泛[1]。近年研究发现，微小RNA(miRNA)可能作为一类新的癌基因或抑癌基因在肿瘤细胞的产生和生长过程中发挥重要作用[2]。由于miRNA可在翻译水平上抑制基因表达，参与细胞生长和分化，推测可能与癌细胞是否耐药存在相关性。为验证上述猜测，本研究通过基因检测技术检测卵巢癌细胞耐药与敏感的miRNA表达差异，并通过Western Blot方法对预测的靶基因表达进行验证，为提高卵巢癌的有效治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 标本获取及检测

选择2016年3月-2020年3月在本院治疗的卵巢癌患者病变标本。利用mirVanaTMRNA Isolation试剂盒(美国Ambion公司)提取 RNA。总RNA浓度、纯度和完整性的验证利用Agilent 2100 Bio analyzer系统自动分析。耐药与敏感细胞均使用1640培养基(10%FBS，青霉素100mg/L，链霉素100mg/L)，在30nmol/L紫杉醇条件下，使得SKOV3-TR30细胞维持耐药。在稳定的培养条件下获得对数生长期细胞进行下一步实验，培养环境设置为温度37.5℃、湿度饱和、5%CO2。

1.2 芯片杂交及数字化处理

将提取出的RNA通过添加多聚腺苷酸尾(polyA)与荧光标记链接，应用miRNA寡核苷酸基因芯片试剂盒(Affymetrix)进行芯片杂交。按照Gene Chip Hybridization Wash and Stain(Affymetrix)试剂盒，全自动洗脱染色工作站(Fluidics Station 450)进行染色。Affymeterix GeneChip Commond Console 1.1软件读取图像文件得到Cel原始数据；应用miRNA QC tool 处理得到txt标准化数据。与SKOV3相比，当比值>1时认为miRNA高表达，<1时低表达。采用Real-time PCR对芯片进行验证。

1.3 miRNA目标靶基因分析及其蛋白表达

为提高靶基因预测的准确性，利用4种生物学分析软件进行综合分析，筛选3种以上软件中有共同结果的基因作为靶基因，其中用到的生物学软件有Target Scan、Pictar、miRanda和miR Base Targets，采用方法为缺省设置综合分析。采……