杨化兰冯美艳涂志兰杨丹金芃芃余波侯双兴*

1上海市浦东医院神经内科

2海军军医大学附属长征医院神经内科

3上海市浦东医院科创中心

4上海市浦东医院血管外科

偏头痛与良性阵发性位置性眩晕（Benign Paroxysmal Positional Vertigo,BPPV）发生密切相关，研究发现偏头痛患者中BPPV的发生率明显较高[1]，但是具体机制未明。偏头痛的发生比较公认的理论是炎症机制，认为三叉神经无菌性炎症是偏头痛发生的关键环节，硬膜上的三叉神经血管系统被激活后释放血管活性物质，然后引发瀑布样级联反应，引起血管舒张、血浆蛋白渗出、肥大细胞脱颗粒，释放致炎性细胞因子，如IL-1、IL-6、TNF-α，以及前列腺素和缓激肽，引发无菌性神经源性炎症促使偏头痛发作[2]。若此种炎症因子扩散入内耳引发内耳无菌性炎症，是否会破坏内耳耳石正常结构，促使BPPV的发生是我们研究的内容。耳石蛋白OC90对于耳石正常结构的维持是至关重要的[3]，研究发现OC90敲除后耳石结构将不能维持正常。本实验主要应用Western blot方法观察偏头痛模型大鼠内耳耳石蛋白OC90的表达情况，内耳炎症因子的表达情况，以及应用能够抑制炎症因子表达的羟苯磺酸钙后对于炎症因子以及OC90表达的影响。从分子角度探讨偏头痛与BPPV发生密切相关的机制。

1 材料与方法

1.1 大鼠偏头痛模型建立与分组

18只健康SPF级Wistar雌性SD大鼠分别分成2组，对照组6只皮下注射生理盐水，其它制作慢性偏头痛模型，慢性偏头痛模型采用的是连续臀部皮下注射硝酸甘油的方法，每次臀部皮下注射时间为8:00，一周一次，偏头痛组注射硝酸甘油后大鼠更容易出现双耳发红、前肢频繁搔抓头部、爬笼次数增多、躁动不安的表现，实验中记录了最终一次注射后2小时内挠头次数，挠头出现时间以大鼠出现连续挠头次数达5次以上为标志，消失时间以一个时间段中大鼠挠头次数少于5次并出现倦怠、疲乏的表现为标志。偏头痛模型的大鼠挠头持续时间（669±47秒）较对照组（113±13秒）明显增加，差异有统计学意义。偏头痛模型组再随机分为两组，一组6只生理盐水灌胃组，另外6只应用羟苯磺酸钙干预，称为羟苯磺酸钙干预组。于第五周最后一次注射后的1周内每天灌胃给药2次（最后一天灌胃1次，所用羟苯磺酸钙，87.8 mg/kg，上海朝晖药业有限公司，其余鼠用同等体积的生理盐水灌胃，以上灌胃均是每日第一次为8:00，第二次为16:00）。最后一天早上灌胃后，当天14:00断头岩骨内取内耳，两侧内耳均需要取下。

1.2 Western blot试验

蛋白提取前需要对内耳进行研磨，低速离心去掉骨组织，应用Western blot方法检测OC90蛋白表达水平，以及炎症因子IL-6，TNF-α的表达变化，裂解液为PH 7.4的10 mM Hepes，0.42 mmol/L KCL，5 mmol/L Mgcl，PH 7.4的1 mmol/L EDTA，1 mmol/L LPMSF，1 mmol/L DTT及蛋白酶抑制剂，一抗使用 otoconin-90 antibody(SC-376855)，β-actin antibody(SC-8035)，IL-6 antibody（SC-57315），TNF-α antibody（3707S，CST）。

1.3 扫描电镜

观察椭圆囊耳石蛋白，应用复旦大学电镜实验室SU8010场发射扫描电镜。

1.4 统计学处理

Western bolt结果以及电镜计数应用组间非配对t-test统计，以均数±标准差（）表示，以P＜0.05为有统计学差异。

2 研究结果

2.1 三组大鼠内耳耳石蛋白OC90表达水平

与对照组组相比，偏头痛模型组（Migraine）大鼠内耳炎症因子IL-6表达水平明显增高（P=0.02，图2），TNF-α表达水平明显升高（P=0.003，图2），而耳石蛋白OC90表达明显降低（P=0.03，图1），与慢性偏头痛模型组相比，羟苯磺酸钙干预组（Migraine+Calcium Dobesilate）内耳炎症因子IL-6，TNF-α表达水平明显降低（P=0.04，图2），且otoconin-90表达明显升高（P=0.04，图 1）。

图1 慢性偏头痛模型组（Migraine）、羟苯磺酸钙干预组（Migraine+Calcium Dobesilate），以及对照组（Control）大鼠的内耳耳石蛋白OC90的表达量比较（n=6，*P＜0.05,与对照组相比较）。Fig.1 The expression of OC90 in inner ear of rats of Migraine group、Migraine+Calcium Dobesilate group and Control group（n=6，*P＜0.05,compared with the Control group）.

图2 慢性偏头痛模型组（Migraine）、羟苯磺酸钙干预组（Migraine+Calcium Dobesilate），以及对照组（Control）大鼠的内耳炎症因子IL-6、TNF-α的表达量比较（n=6，*P＜0.05,与对照组相比较）。Fig.2 The expression of IL-6、TNF-α in inner ear of rats of Migraine group、Migraine+Calcium Dobesilate group and Control group（n=6，*P＜0.05,compared with the Control group）.

2.2 三组大鼠椭圆囊耳石的扫描电镜结果

比较慢性偏头痛模型组、羟苯磺酸钙干预组，以及对照组，三组数量上并无统计学差异（比较单位面积的耳石数量，t-test，P=0.28），仅形态学上显示慢性偏头痛组耳石裂缝较多（见图3）。

图3 大鼠耳石扫描电镜图(×3000)。A慢性偏头痛模型组；B羟苯磺酸钙干预组；C对照组；D为放大的裂隙比较明显的耳石图片。箭头所示代表性的有裂隙的耳石。Fig.3 The scanning electron micrograph of rat otoliths(×3000).A:Migraine group;B:Migraine+Calcium Dobesilate group;C:Control group.D:An enlarged picture of otoliths with obvious cracks.The arrow shows representative otoliths with cracks.

3 讨论

眩晕人群中偏头痛患病率为普通人群的3-4倍，偏头痛人群中，BPPV的患病率远高于普通人群，BPPV的人群中很多有偏头痛病史[4，5]。随着认识的深入，目前大家对偏头痛与眩晕关系密切已经认同，并提出前庭性偏头痛的概念以及相关的诊断标准[6]。由于具体机制不明，导致治疗上欠缺，研究偏头痛与耳石的关系的分子机制对于偏头痛相关的眩晕的治疗甚至前庭性偏头痛的治疗显得非常重要。

耳石变性后耳石脱落是BPPV发作的一个重要原因，研究发现OC90敲除的小鼠耳石扫描电镜显示松散变大变稀少，无法形成正常的耳石结构[7]。OC90与其他耳石蛋白相互作用形成带有负电的耳石基质，吸引带正电的钙离子沉积，共同形成耳石结构[8]，耳石蛋白OC90对于维持正常耳石结构至关重要[3]。

偏头痛发病机制比较公认的是三叉神经血管疼痛学说，炎症扩布除了导致中枢敏化外，对于偏头痛的炎症反应与相关的内耳功能紊乱研究发现迷路内前庭神经也有炎症渗出[9]，那么这种炎症是否也会引起内耳的炎症反应，造成内耳耳石蛋白的表达受抑制从而导致耳石脱落是本研究的重点。偏头痛的三叉神经血管炎症学说一直是主流学说，三叉神经受到刺激时，其传出神经末梢会释放大量的血管活性肽：CGRP、P物质（SP）、神经激肽 A（NKA），这些血管活性肽，将使得硬脑膜及其周围发生血管扩张、血浆蛋白渗出、肥大细胞脱颗粒等无菌性炎症现象，进而引起组胺、5-羟色胺、白细胞介素等炎性物质释放[10]，炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1与偏头痛发作的病理生理机制相关[11]。由于生理位置的靠近，这种炎症很可能波及到内耳，在我们研究中果然发现偏头痛模型内耳中IL-6、TNF-α表达升高，提示内耳有炎症反应，并且发现OC90表达减少，并且随后的电镜扫描实验的确发现了慢性偏头痛组大鼠的耳石数量虽然没有明显减少，但形态发生了改变，出现更多的裂隙，提示耳石的稳定性有变化，因此提示偏头痛模型中发生的这种炎症反应可能造成了内耳耳石正常结构的受损。这或许能够在一定程度上提示偏头痛与BPPV的发生的分子相关性。但是耳石结构改变后是否带来前庭功能改变，以及炎症与耳石蛋白表达改变的分子信号通路仍需进一步研究。

羟苯磺酸钙作为一种血管保护剂，有抗炎改善微循环的作用，目前被发现能够抑制毛细血管活性物质如缓激肽、前列腺素、组胺、5-HT等的释放抑制无菌性炎症扩布，主要经胃肠道吸收，最早用于糖尿病视网膜病变的治疗，目前临床上已经发展成用于糖尿病肾病、慢性肾病、慢性静脉功能不全的治疗[12]，Qin L的一项对于糖尿病肾病的研究中发现相比单纯应用前列地尔，联合应用羟苯磺酸钙能够有效降低血炎症因子IL-6、TNF-α表达[13]。偏头痛作为一种血管无菌性炎症过程，我们研究发现在偏头痛模型大鼠中有抑制大鼠内耳炎症因子IL-6、TNF-α表达的作用，能够改善内耳OC90的表达，临床上羟苯磺酸钙对于与偏头痛相关的BPPV的治疗、甚至前庭性偏头痛的治疗是否有价值，是我们下一步值得研究的。目前前庭性偏头痛仍缺乏有效的药物治疗，基于本研究的提示，接下来的实验中希望开展羟苯磺酸钙对前庭性偏头痛患者的前庭功能是否有改善作用的临床试验研究，希望能够寻找到新的前庭性偏头痛的治疗药物。