石 磊 马玉林 方 圆 周银芳

(陕西省安康市中心医院1 麻醉科，2 检验科，安康市 725000，电子邮箱：shilei251204191@126.com)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种慢性肝病，其疾病谱包括单纯性脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)、肝硬化和肝细胞癌[1]。高热量饮食导致的脂质堆积是诱发NAFLD的首要病因，在我国，脂肪肝的发病率以每年0.594% 的速度增长[2-3]。NAFLD的进展受到多种机制调控，如脂质堆积、氧化应激、炎性级联反应等[4-6]。NAFLD的主要治疗方案包括饮食控制、体重控制、运动和药物控制，但效果不明显[7]。许多药物(如他汀类、贝特类)常伴有不良反应的发生[8]。因此，亟待寻找疗效确切、无副作用的治疗NAFLD的药物。丙泊酚是临床上广泛使用的静脉全麻药物，具有可迅速唤醒的优点，可连续输注且在体内无积累[9]。研究表明，丙泊酚对肾脏和肝脏等器官具有积极的保护作用，可保护肝缺血/再灌注损伤[10-12]。但是目前关于丙泊酚在NAFLD治疗中的作用的研究仍较少。本研究采用高脂高糖饮食建立大鼠NAFLD模型，探讨丙泊酚对NAFLD大鼠模型肝损伤及氧化应激的调节作用。

1 材料和方法

1.1 主要试剂与仪器 丙泊酚(批号：PHR1663)购自美国Sigma公司；HE染液(批号：G1120)、油红O(批号：G1260)染液购自北京索莱宝公司；脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling,TUNEL)试剂盒(批号：QIA39)购自美国Sigma公司；RIPA裂解液(批号：P0013B)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(批号：P0012)购自碧云天生物公司；B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)基因(批号：ab196495)抗体、抗Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)(批号：ab32503)、乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-coA carboxylase，ACC)(批号：ab45174)、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔单克隆IgG二抗、β-肌动蛋白(β-actin，批号：ab6728)均购自英国Abcam公司；抗肉毒碱棕榈酰基转移酶1(carnitine palmitoyl transferase 1，CPT-1)(批号：orb308786)抗体购自英国Biorbyt公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)(批号：A001-1-2)、丙二醛(批号：A003-1-2) 和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)(批号：A020-1-2)检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。3100型全自动生化分析仪购自日本日立公司；Multiskan MK3型酶标仪购自中国赛默飞世尔公司；Mini Protean 3 Cell型电泳仪、CFX Connect96型荧光定量PCR仪均购自美国Bio-Rad公司；Tanon 5200型全自动化学发光分析仪购自上海天能科技有限公司。

1.2 实验动物 40只SPF级健康SD雄性大鼠，3周龄，体重(60±10)g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号为SYXK(京)2019-0022。将大鼠置于恒定温度(23±2)℃的室内，保持12 h/12 h的明暗循环，并自由饮水和进食。

1.3 NAFLD大鼠模型的建立及实验分组 参考文献[13]，适应性喂养7 d后，将40只大鼠按随机数字表法分为对照组、模型组、丙泊酚低剂量组、丙泊酚中剂量组、丙泊酚高剂量组，每组8只。对照组大鼠喂食标准大鼠食物，即每千克食物包含48%玉米、20%大豆粉、10%麦麸、10%面粉、8%鱼粉、2%粉煤灰、1%植物油、0.5%盐和0.5%微量元素，按照1.5 mg/(kg·d)喂食，直至实验结束。模型组与丙泊酚处理组大鼠喂食高脂高糖食物，每千克食物中包含72%标准大鼠食物、20%猪油、2%胆固醇、5%蛋黄粉、1%胆汁盐，按照1.5 mg/(kg·d)喂食；喂养6周后，丙泊酚低剂量组、丙泊酚中剂量组、丙泊酚高剂量组大鼠分别加入25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg丙泊酚继续喂食4周，每天1次，模型组继续喂食高脂高糖食物，直至实验结束。大鼠毛色暗淡无光泽、精神萎靡、饮食量较多和体重增加且血脂异常，表明NAFLD大鼠模型建立成功，建模成功率为81.25%。

1.4 样品采集 丙泊酚处理4周后，将所有大鼠禁食过夜后麻醉，采取大鼠眼眶神经丛血液，约1 mL/只，经3 500 r/min低温离心5 min后，吸取上层血清，储存于-80℃环境中待检。对动物实施安乐死并切除肝脏，称量大鼠肝脏重量，计算肝指数，肝指数=(肝脏重量/大鼠体重)×100%，然后将一部分肝脏置于-80℃下进行蛋白免疫印迹试验，另一部分置于4%多聚甲醛中进行组织学分析。

1.5 全自动生化分析仪测量大鼠血清脂质代谢指标水平 采用全自动生化分析仪检测各组大鼠血清中LDL、三酰甘油、总胆固醇和HDL水平。

1.6 HE染色观察肝脏组织病理学变化 采用4%多聚甲醛溶液固定肝脏组织24 h以上，将肝脏组织置于脱水机内，用浓度由低到高的乙醇依次进行梯度脱水后，于包埋机内进行包埋，随后于石蜡切片机上进行切片，片厚4 μm。然后将切片依次用二甲苯和乙醇进行脱蜡处理，苏木素染色10 min，1%的盐酸乙醇分化，洗净后0.6%氨水返蓝，流水冲洗，伊红染色2 min后，将切片依次用乙醇和二甲苯处理至脱水透明，用中性树胶封片，通过光学显微镜观察肝脏组织病理学变化。

1.7 TUNEL染色检测肝细胞凋亡情况 石蜡组织切片制备同1.6，取石蜡切片用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)清洗3次，每次5 min，然后与含有末端脱氧核苷酸转移酶和生物素化脱氧尿苷三磷酸的TUNEL反应混合物于37℃下孵育1 h，PBS清洗3次，每次5 min，在37℃的洗涤缓冲液中孵育30 min终止反应。在光学显微镜下随机选取5个视野计数TUNEL阳性细胞(棕色)的数量。细胞凋亡率=(TUNEL阳性细胞数/总细胞数)×100%。

1.8 蛋白免疫印迹试验 用RIPA裂解缓冲液在4℃下提取各组大鼠肝组织蛋白质，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白质浓度。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶对等量蛋白质(30 μg)进行电泳，然后转移到聚偏氟乙烯膜上。用含5%脱脂牛奶的TBST封闭膜1 h后，用稀释的一抗Bcl-2(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶2 000)、CPT-1(1 ∶500)和ACC(1 ∶500)4℃孵育过夜。然后，将膜与辣根过氧化物酶结合的二抗(1 ∶3 000)于37℃下孵育1 h，并使用增强化学发光试剂ECL显示条带，用ImageJ定量蛋白灰度值。蛋白相对表达量以目的蛋白与β-actin灰度值的比值表示。

1.9 氧化应激指标水平检测 按照试剂盒说明书，分别采用黄嘌呤氧化酶法(羟胺法)、硫代巴比妥酸法和比色法检测1.4保存的大鼠血清中的SOD、丙二醛和LDH的含量。

1.10 油红O染色观察肝细胞脂质分解情况 石蜡组织切片制备同1.6，取石蜡切片用PBS清洗3次，每次5 min，用油红O工作液浸泡切片10 min，PBS清洗3次，每次5 min，再用油红O染液染色15 min，75%乙醇分化2 s， 37℃蒸馏水洗15 s，然后用苏木素染色，1%的盐酸乙醇分化，洗净后0.6%氨水返蓝，流水冲洗，用中性树脂封片后，在光学显微镜下观测大鼠肝细胞脂质分解情况。脂肪被染成鲜红色，细胞核染成深蓝色。

1.11 统计学分析 采用SPSS 18.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠肝重量和肝指数的比较 模型组大鼠的肝脏重量和肝指数均高于对照组(均P<0.05)；丙泊酚中、高剂量组大鼠的肝脏重量低于模型组，且丙泊酚高剂量组大鼠的肝脏重量均低于丙泊酚中剂量组(均P<0.05)，而丙泊酚低剂量组大鼠的肝脏重量和肝指数与模型组比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠肝脏重量和肝指数的比较(x±s)

2.2 各组大鼠血清脂质代谢指标水平的比较 模型组大鼠的血清LDL、三酰甘油、总胆固醇水平均高于对照组，血清HDL水平低于对照组(均P<0.05)；丙泊酚中、高剂量组大鼠的血清LDL、三酰甘油、总胆固醇水平均低于模型组，血清HDL水平高于模型组，且丙泊酚高剂量组大鼠的血清LDL、三酰甘油、总胆固醇水平均低于丙泊酚中剂量组，血清HDL水平高于丙泊酚中剂量组(均P<0.05)，而丙泊酚低剂量大鼠的血清LDL、三酰甘油、总胆固醇、HDL水平与模型组比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清脂质代谢指标水平的比较(x±s)

2.3 各组大鼠肝脏组织病理变化及细胞凋亡率的比较 对照组大鼠的肝脏组织形态正常，模型组大鼠的肝小叶结构紊乱、极度肿胀、脂肪空泡大，细胞脂肪变性或坏死增加；与模型组相比，丙泊酚处理组大鼠的肝脏组织病变程度呈剂量依赖性减轻，肝小叶排列逐渐整齐，脂肪空泡变小，细胞脂肪变性减少，见图1。模型组大鼠的肝脏组织细胞凋亡率及Bax与Bcl-2相对表达量的比值(Bax/Bcl-2)均高于对照组(均P<0.05)；丙泊酚中、高剂量组大鼠的肝脏组织细胞凋亡率及Bax/Bcl-2均低于模型组，且丙泊酚高剂量组大鼠的肝脏组织细胞凋亡率及Bax/Bcl-2均低于丙泊酚中剂量组(均P<0.05)；而丙泊酚低剂量大鼠的肝脏组织细胞凋亡率与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，但肝脏组织Bax/Bcl-2低于模型组(P<0.05)。见表3，图2。

表3 各组大鼠肝脏组织细胞凋亡率及Bax与Bcl-2相对表达量比值的比较(x±s)

图1 各组大鼠肝脏组织病理学变化及肝细胞凋亡情况[HE染色(×400)、TUNEL染色(×400)]

图2 各组大鼠Bcl-2和Bax蛋白表达情况

2.4 各组大鼠血清氧化应激指标水平的比较 模型组大鼠的血清丙二醛、LDH水平均高于对照组，血清SOD水平低于对照组(均P<0.05)；丙泊酚中、高剂量组大鼠的血清丙二醛、LDH水平均低于模型组，血清SOD水平高于模型组，且丙泊酚高剂量组大鼠的血清丙二醛、LDH水平均低于丙泊酚中剂量组，血清SOD水平高于丙泊酚中剂量组(均P<0.05)，而丙泊酚低剂量组大鼠血清丙二醛、LDH、SOD水平与模型组比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表4。

表4 各组大鼠血清氧化应激指标水平的比较(x±s)

2.5 各组大鼠肝细胞脂质分解情况及ACC、CPT-1相对表达量的比较 对照组大鼠肝脏组织中的小脂质滴散布在少量肝细胞中，模型组大鼠肝细胞充满了大小不同的红色脂滴，融合成片，看不清细胞结构；与模型组相比，随着丙泊酚剂量的增加，大鼠肝细胞中脂质滴明显变小、减少，见图3。模型组大鼠的肝脏组织CPT-1相对表达量低于对照组，ACC相对表达量高于对照组(均P<0.05)；丙泊酚中、高剂量组大鼠的肝脏组织CPT-1相对表达量均高于模型组，且丙泊酚高剂量组大鼠的肝脏组织CPT-1相对表达量高于丙泊酚中剂量组(均P<0.05)；丙泊酚低、中、高剂量组大鼠的肝脏组织ACC相对表达量均低于模型组，且丙泊酚高剂量组大鼠肝脏组织的ACC相对表达水平低于丙泊酚中剂量组(均P<0.05)，见表5，图4。

表5 各组大鼠肝脏组织ACC、CPT-1相对表达量的比较(x±s)

图3 大鼠肝脏脂肪细胞油红O染色(×400)

图4 各组大鼠ACCHE CPT-1蛋白表达的情况

3 讨 论

高热量食物的摄入会导致脂质堆积、炎性细胞因子过度产生和巨噬细胞浸润，从而促进肝病的进展[14]。因此，高脂、富含胆固醇的饮食通常用于高脂血症和NAFLD的实验诱导。研究表明，给大鼠喂食高脂饲料可引起大鼠出现胰岛素抵抗、脂质代谢异常和肝脏损伤等NAFLD疾病特征[15]。本研究通过高脂高糖饮食诱导建立NAFLD大鼠模型，结果显示，模型组大鼠的肝脏重量和肝指数均较对照组明显升高(均P<0.05)，表明模型组大鼠已存在脂肪肝；丙泊酚中、高剂量组大鼠的肝脏重量和肝指数均低于模型组，且丙泊酚高剂量组肝脏重量低于丙泊酚中剂量组(均P<0.05)，而丙泊酚低剂量组大鼠的肝脏重量和肝指数与模型组比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，提示给予高剂量(100 mg/kg)的丙泊酚干预能够有效地减轻NAFLD大鼠的肥胖体征。

“两次打击”理论是目前大多数学者认可的影响NAFLD进展的作用机制，即第一次打击是肝细胞中脂质的堆积，第二次打击是氧化应激诱导的脂毒性，其促进了NASH的细胞损伤[16-17]。HDL主要由肝脏合成，因其体积小而能够自由进出动脉管壁并摄取沉浸在血管壁内膜底层的LDL、三酰甘油、总胆固醇等有害物质，然后将这些有害物质转运到肝脏进行代谢清除[18]。总胆固醇、三酰甘油和LDL水平升高以及HDL水平降低是高脂血症的主要症状，而血脂异常是NAFLD的主要危险因素，血清三酰甘油、总胆固醇、LDL和HDL水平能够反映NAFLD的病变程度[19]。本研究结果显示，模型组大鼠的血清LDL、三酰甘油、总胆固醇水平均高于对照组，血清HDL水平低于对照组(均P<0.05)，这表明模型组大鼠血脂异常、脂质代谢紊乱；丙泊酚中、高剂量组大鼠的血清LDL、三酰甘油、总胆固醇水平均低于模型组，血清HDL水平高于模型组，且丙泊酚高剂量组大鼠的血清LDL、三酰甘油、总胆固醇水平均低于丙泊酚中剂量组，血清HDL水平高于丙泊酚中剂量组(均P<0.05)，而丙泊酚低剂量组大鼠的血清LDL、三酰甘油、总胆固醇、HDL水平与模型组比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，这提示给予高剂量(100 mg/kg)的丙泊酚干预能降低NAFLD大鼠血清三酰甘油、总胆固醇和LDL水平，提高HDL水平，具有明显的降脂作用。

作为NAFLD诊断的“黄金标准”，HE染色为评估药物的抗肝脂肪变性作用提供了可靠证据。本研究HE染色结果显示，NAFLD大鼠的肝小叶结构紊乱、极度肿胀、脂肪空泡大，细胞脂肪变性或坏死增加，而丙泊酚能够有效地改善肝组织病变。研究证实，丙泊酚可通过调节Toll样受体4/核因子κB/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3途径减轻炎症反应和细胞凋亡，从而保护D-半乳糖胺/脂多糖诱导的急性肝损伤[10]。本研究结果显示，模型组大鼠的肝脏组织细胞凋亡率及Bax/Bcl-2均高于对照组(均P<0.05)；丙泊酚中、高剂量组大鼠的肝脏组织细胞凋亡率，以及丙泊酚低、中、高剂量组大鼠的肝脏组织Bax/Bcl-2均低于模型组，且丙泊酚高剂量组大鼠的肝脏组织细胞凋亡率及Bax/Bcl-2均低于丙泊酚中剂量组(均P<0.05)，这提示：给予高剂量(100 mg/kg)的丙泊酚干预对NAFLD大鼠的肝损伤具有明显的保护作用。

氧化应激是NASH发病和病情进展的主要决定因素[20]。丙二醛是脂质过氧化降解的主要产物，它会引起膜蛋白和酶反应，增强膜通透性，改变细胞膜的结构、功能和新陈代谢，最终对人体造成伤害[21]。SOD是一种包含金属元素的酶，广泛分布于各种生物中，可以消除自由基并防止体内脂质氧化损伤[22]。LDH是一种糖酵解酶，可以催化丙酮酸生成乳酸，是肝损伤的标志物[23]。丙泊酚含有抗氧化活性的酚羟基，可通过抑制活性氧释放，降低H9c2细胞衰老相关基因的蛋白表达，从而具有心脏保护作用[24]。本研究结果显示，模型组大鼠的血清丙二醛、LDH水平均高于对照组，血清SOD水平低于对照组(均P<0.05)；丙泊酚中、高剂量组大鼠的血清丙二醛、LDH水平均低于模型组，血清SOD水平高于对照组，且丙泊酚高剂量组大鼠的血清丙二醛、LDH水平均低于丙泊酚中剂量组，血清SOD水平高于丙泊酚中剂量组(均P<0.05)，而丙泊酚低剂量组大鼠血清丙二醛、LDH、SOD水平与模型组比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，这提示丙泊酚能提高大鼠的抗氧化能力，给予高剂量(100 mg/kg)的丙泊酚可以通过抑制氧化应激反应来减轻NAFLD大鼠的肝损伤。

油红O是一种脂溶性偶氮染料，能特异性地使组织和细胞内中性三酰甘油、脂质以及脂蛋白等染成红色。本研究结果显示，模型组大鼠肝细胞油红O染色脂滴呈弥漫性分布，且肝细胞中分解代谢标志物CPT-1相对表达量低于对照组，合成代谢标记物ACC高于对照组，丙泊酚中、高剂量组大鼠的肝脏组织CPT-1相对表达量均高于模型组，丙泊酚低、中、高剂量组大鼠的肝脏组织ACC相对表达量均低于模型组，且丙泊酚高剂量组大鼠的肝脏组织CPT-1相对表达量高于丙泊酚中剂量组、ACC相对表达量低于丙泊酚中剂量组(均P<0.05)。这提示，丙泊酚可减少NAFLD大鼠肝细胞中的脂质滴，并上调CPT-1及下调ACC的表达，给予高剂量(100 mg/kg)的丙泊酚干预可促进NAFLD大鼠肝细胞中脂质的分解以阻止NAFLD进展。

综上所述，给予高剂量(100 mg/kg)的丙泊酚干预不仅能够降低NAFLD大鼠的肝脏重量及肝指数，调节NAFLD引起的脂质代谢紊乱、促进脂质分解，还可以缓解氧化应激及细胞凋亡造成的肝损伤，阻止NAFLD的进一步发展。