张怡华 吕晓丹 曾睿智 韩 冰 张维维 徐小芳 陈如艳 叶卫政 陈晓战 范俊华 詹灵凌 吕小平

(广西医科大学第一附属医院1 消化内科，2 检验科， 南宁市 530021，电子邮箱：624785938@qq.com)

炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)以胃肠道不受控制的慢性炎症为特征，主要包括溃疡性结肠炎和克罗恩病，其患病率逐年增加[1]。IBD的病因尚未完全明确，其与遗传、免疫功能紊乱、肠道菌群失调、肠道屏障受损及环境等因素均有密切的关系，已成为全球性的健康问题[2-3]。目前治疗IBD的药物主要有5-氨基水杨酸类药物、糖皮质激素、免疫抑制剂，这三类药物对溃疡性结肠炎或克罗恩病有一定的治疗效果，但都有其各自的局限性及不良反应[4]。

金雀异黄素(genistein，GEN)是一种大豆中天然存在的异黄酮类物质，化学名为4′,5,7-三羟基异黄酮，不溶于水，但可溶于常用的有机溶剂。有研究表明，GEN有多种生物学作用，包括抗氧化、抗炎和抗癌[5-6]。还有研究表明GEN能显著降低白细胞介素(interleukin,IL)-1、IL-6的表达水平，且能显著抑制HCT116细胞系中的核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)的核转位，以及核因子κB抑制蛋白(inhibitor of nuclear factor κB,IκB)和核因子κB抑制蛋白激酶(inhibitor of nuclear factor κB kinase,IKK)α/β的磷酸化[7]，而NF-κB信号通路在炎症、适应性免疫反应中起着重要的调节作用[8]。p65是NF-κB家族成员之一，其一般以二聚体的形式存在。在未受到刺激时，这种二聚体被IκB-α隔离在胞质中；受到刺激时，IκB-α被磷酸化和降解，使游离的二聚体进入细胞核内，进而激活靶基因的转录，促进炎症的发生、发展[9-10]。由此可见，GEN可能可通过调节NF-κB信号通路参与炎症反应。本研究旨在探讨GEN对三硝基苯磺酸(trinitro-benzene sulfonic acid，TNBS)诱导的结肠炎小鼠模型的干预作用，并基于NF-κB 信号通路探讨其作用机制，旨在为治疗IBD的新药研发提供理论依据和实验参数。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 健康雄性C57BL/6小鼠32只，6～8周龄，体重为20～22 g，购于北京维通利华实验动物中心(许可证号:SCXK 京2021-0011)。在无特定病原体级动物房里饲养，环境相对湿度为60%，温度为24℃。给予所有小鼠自由进食、饮水1周后用于实验。按随机数字表法将小鼠分为正常对照组、模型组、柳氮磺砒啶组、GEN组，每组8只，并用耳标做好标记分别饲养。

1.2 主要试剂 GEN(批号：A2198)由APExBIO公司生产；TNBS(批号：P2297)由Sigma-Aldrich公司生产；柳氮磺砒啶由上海信宜天平药业有限公司生产；肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α；批号：EM0183)、IL-1β(批号：EM0109)、IL-10(批号：EM0100)ELISA试剂盒由武汉菲恩生物科技有限公司生产；兔单抗NF-κBp65抗体由Abcam公司生产；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体由Abcam公司生产(批号：ab181602)；兔单抗IκB抗体由Abmart公司生产；蛋白酶抑制剂(批号：A8260)、RIPA裂解液(批号：R0010)；洗膜缓冲液(TBST,批号：1085)、磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)、聚偏氟乙烯膜(批号：ISEQ00010)均由Solarbio公司生产。

1.3 构建TNBS诱导的结肠炎小鼠模型与药物干预 参照相关文献[11-12]的方法进行造模：所有小鼠于造模前1 d禁食不禁水，正常对照组给予生理盐水(4 mL/kg)灌肠，其余3组给予2.5%的TNBS溶液(4 mL/kg)灌肠。建模后第2天若小鼠出现明显的体重下降，大便性状改变或血便，则可以初步确定小鼠造模成功，随后在镜下观察小鼠结肠病理切片进一步确定。确定造模成功后再进行干预。造模第2天，给予正常对照组、模型组生理盐水(8 mL/kg)灌胃，对柳氮磺砒啶组小鼠用柳氮磺砒啶(450 mg/kg)(柳氮磺砒啶用生理盐水溶解)灌胃，GEN组小鼠用 GEN(20 mg/kg)灌胃，药物的灌胃剂量参照相关文献[13-14]及预实验结果,均为1次/d，连续给药7 d。实验期间若有小鼠建模不成功或死亡，则进行等量补充。

1.4 评估小鼠的疾病活动指数 于造模后第2天开始至给药结束，参照相关标准[15]，评估各组小鼠的疾病活动指数(disease activity index，DAI)，最后取7 d的平均值作为小鼠的DAI,评分标准见表1。

表1 DAI评分表

1.5 获取标本 连续给药7 d后采用颈椎脱臼法处死小鼠。眼眶采取800～1 000 μL血液，静置至第2天，4℃环境下3 000 r/min离心10 min后取上层血清用于检测炎症因子水平；分离结肠组织，观察大体形态后，将部分结肠用4%多聚甲醛固定，其余结肠组织放于-80℃冰箱中保存。

1.6 评估结肠形态 取近肛门端直肠至盲肠的结肠段，测量长度，剖开清理后观察并测量溃疡的大小，评估结肠大体形态损伤指数(colon macroscopic damage index，CMDI)[16]，CMDI 评分标准见表2。

表2 CMDI评分标准

1.7 观察结肠病理变化 取近端肛门处结肠组织进行石蜡包埋、制作切片、HE染色，然后在显微镜下观察结肠组织的病理变化。

1.8 相关指标检测

1.8.1 血清炎症因子水平：取离心后的血清，根据试剂盒说明书，采用ELISA法检测血清IL-1β、IL-10、TNF-α 水平。使用iMark型全自动酶标仪(美国Bio-Rad公司)测定450 nm 波长处各孔的光密度值。以标准品的光密度值，绘制标准曲线，通过标准曲线计算标本各指标的浓度。

1.8.2 结肠组织IκB-α和p65蛋白表达水平：采用蛋白免疫印迹法检测结肠组织中IκB-α和p65的蛋白表达水平。随机取30 mg的结肠组织用冷PBS冲洗2～3次后置于匀浆管中。加入2个2 mm磁珠、300 μL含蛋白酶抑制剂和RIPA裂解液的混合液后，置于研磨仪(武汉赛维尔科技有限公司)进行研磨。研磨结束后放置冰上静置30 min，吸取上清，利用RF-5301PC型分光光度计(日本岛津公司)上检测蛋白样品浓度。然后将5×蛋白上样缓冲液与蛋白样品按照4 ∶1混匀后，再进行沸水浴10 min。蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(分离胶用 120 V，浓缩胶电压75 V)后进行1 h的转膜，将蛋白转移至聚偏氟乙烯膜(200 mA)上，用 TBST洗膜3次(10 min/次)。5%脱脂牛奶封闭 1 h，用 TBST洗膜3次(10 min/次)，4℃孵育一抗(稀释比例为1 ∶20 000)过夜。第2天用TBST洗膜3次(10 min/次)，室温下孵育二抗(稀释比例为1 ∶10 000)1 h后，用TBST洗膜3次(10 min/次)。然后用Odyssey双色红外激光成像系统(美国LI-COR公司)进行扫膜，再利用ImageJ软件分析目的条带灰度值。以GAPDH为内参，目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带的灰度值/内参蛋白条带的灰度值。

1.9 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料用(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠的一般情况和DAI的比较 造模后第2天，除正常对照组外，其他组小鼠开始出现大便异常，体重下降；但柳氮磺砒啶组和GEN组小鼠经过灌胃相应的药物后，大便性状、便血及体重下降情况均较模型组有所改善。模型组、柳氮磺砒啶组的DAI高于正常对照组，而柳氮磺砒啶组和GEN组的DAI均低于模型组(均P<0.05)，但GEN组与柳氮磺砒啶组的DAI差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

2.2 各组小鼠的结肠长度和CMDI的比较 与正常对照组相比，其余3组小鼠的结肠均缩短，且出现不同程度溃疡和炎症等结肠损伤表现，CMDI升高(均P<0.05)；而与模型组相比，GEN组与柳氮磺砒啶组小鼠的结肠长度增加，CMDI降低(均P<0.05)；但GEN组与柳氮磺砒啶组小鼠的结肠长度和CMDI比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表3。

表3 4组小鼠DAI 、结肠长度和CMDI的比较(x±s)

2.3 各组小鼠的结肠病理变化 正常对照组小鼠的结肠组织形态正常，而模型组小鼠的结肠组织中炎症细胞浸润明显，程度较重，进一步证实建模成功；柳氮磺砒啶组和GEN组小鼠的结肠组织虽有炎症细胞浸润，但程度较模型组减轻。见图1。

图1 各组小鼠结肠组织病理改变(HE染色，×100)

2.4 各组小鼠的血清炎症因子水平的比较 与正常对照组比较，模型组和柳氮磺砒啶组血清TNF-α水平升高，3组血清IL-1β水平均升高，模型组血清IL-10水平降低，而柳氮磺砒啶组和GEN组血清IL-10水平升高(均P<0.05)。与模型组比较，柳氮磺砒啶组和GEN组血清TNF-α与IL-1β水平降低，而血清IL-10水平升高(均P<0.05)。与柳氮磺砒啶组相比，GEN组血清IL-1β水平降低而血清IL-10水平升高(均P<0.05)，但两组血清TNF-α水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 4组小鼠血清炎症因子水平的比较(x±s，ng/mL)

2.5 各组小鼠结肠组织中IκB-α蛋白与p65蛋白相对表达量的比较 模型组的IκB-α蛋白与p65蛋白相对表达量均高于其余各组(均P<0.05)；柳氮磺砒啶组和GEN组的IκB-α蛋白、p65蛋白相对表达量与正常对照组相比，差异均无统计学意义(均P>0.05)；GEN组的p65蛋白相对表达量高于柳氮磺砒啶组(P<0.05)，但两组的IκB-α蛋白相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)。见表5和图2。

表5 4组小鼠结肠组织中IκB-α蛋白与p65蛋白相对表达量的比较(x±s)

图2 4组小鼠结肠组织中IκB-α蛋白和p65蛋白的表达情况

3 讨 论

IBD是一组病因未明的慢性肠道炎症性疾病，可能与遗传、生物等因素有关，因患病率逐年升高，其已成为全球常见的消化系统疾病[17]。目前，治疗IBD的常见药物之一为生物制剂。不可否认，生物制剂具有疗效好、起效快等优点，但由于价格、免疫原性及长期应用的疗效和安全性等原因使其难以成为IBD患者的最优选择[18-20]。另外，对于一部分患者而言，生物制剂的治疗效果并不理想，需要寻找更佳的治疗药物。GEN是一类植物雌激素，为大豆的主要成分，在豆类食品中含量丰富，被人体摄取后主要以糖苷的形式存在[21]，具有酪氨酸激酶抑制剂活性，参与多种生物过程，可发挥抗氧化、抗炎和抗肿瘤等多种作用[22-23]。在东方的饮食结构中，大豆是不可或缺的食物，亚洲人群的豆制品食用量高于欧美各国人群[24]，《中国居民膳食指南(2019)》[25]也建议每人每天应摄取30～50 g大豆或相当量的豆制品，而食用大豆可增加GEN的摄入量[26]。这为我们开展GEN治疗IBD的作用机制研究提供了现实依据，且GEN治疗IBD在国外是研究热点之一，这说明GEN具有潜在的研究价值。

本研究结果显示，建模后模型组结肠炎小鼠出现体重下降，排血便或无便，结肠缩短，且DAI和CMDI均升高(均P<0.05)，提示结肠炎小鼠模型建模成功；与模型组相比，GEN组小鼠的大便性状、便血及体重下降等情况均有所改善，结肠长度增加，DAI和CMDI均降低(均P<0.05)。这提示GEN可以减轻结肠炎小鼠的疾病活动程度，缓解溃疡和炎症等结肠损伤情况，有效改善结肠炎小鼠的症状。此外，模型组小鼠肠壁炎症细胞的浸润程度显著增加，血清中促炎因子IL-1β、TNF-α水平升高，而抗炎因子IL-10水平降低(均P<0.05)；GEN组小鼠肠壁炎症细胞浸润情况较模型组减轻，且促炎因子水平降低，抗炎因子水平升高(均P<0.05)。这表明GEN对TNBS所致的结肠炎小鼠具有一定的抗炎作用。而与柳氮磺砒啶组相比，GEN组促炎因子IL-1β水平更低，抗炎因子IL-10水平更高(均P<0.05)，这提示GEN具有更优的抗炎作用。虽然GEN组的DAI和CMDI高于柳氮磺砒啶组，但差异并无统计学意义(均P>0.05)，这可能与样本量较小、观察时间较短等因素有关。

NF-κB信号通路是调节炎症的关键通路，位于胞质中无活性的NF-κB可经TNF-α、IL-1等多种刺激因子诱导而被激活。NF-κB通路被激活后，IκB被IKK磷酸化，磷酸化后的IκB 被26S蛋白酶小体降解，进而使NF-κB被释放进入细胞核进行转录，促进与炎症相关的组织损伤的发生[27]。有研究表明，NF-κB信号通路在促进炎症的发展中起重要作用，其在结肠炎小鼠结肠黏膜中的表达升高[28]。还有研究表明，激活NF-κB的复合物主要成分为p65蛋白，当NF-κB活性增强时，p65蛋白的水平上调，从而促进肠道炎症的发展[29-30]。因此，本研究通过检测结肠组织IκB-α和p65蛋白的相对表达情况，了解GEN对结肠炎的干预作用是否与NF-κB信号通路有关。结果显示，模型组小鼠结肠组织中 IκB-α蛋白和p65蛋白的相对表达量升高，而GEN组小鼠结肠组织中 IκB-α蛋白及p65蛋白的相对表达量均低于模型组(均P<0.05)。这表明GEN能够下调IκB-α和p65蛋白的表达水平，从而抑制NF-κB信号通路的激活。由此推测，GEN对TNBS诱导的结肠炎小鼠的干预作用，可能与其抑制了NF-κB信号通路的活性，从而发挥抗炎作用有关[31]。

综上所述，GEN能够抑制TNBS诱导的结肠炎小鼠的炎症反应从而缓解症状，作用机制可能与其抑制NF-κB信号通路有关，其或可成为治疗IBD的潜在药物。本研究存在以下不足：GEN对TNBS所致结肠炎小鼠的抗炎作用的具体机制还未完全了解，尤其在基因层次的研究尚有不足，也无法得知GEN是否还通过其他信号通路发挥其抗炎的作用，此外GEN用于治疗结肠炎可能会产生的副作用也尚未完全清楚。因此，今后还需深入研究探讨GEN治疗结肠炎的疗效、确切作用机制和安全性。