宋滨阳 孙健 朱杰 王娇 李伟平 陈雪瑜 慕俐君

ITP是一种自身免疫性疾病，由于针对自身反应的B淋巴细胞增殖及分化，产生血小板膜糖蛋白抗体，导致血小板破坏过多，生成减少[1]。B淋巴细胞通过生成抗体、抗原提呈及分泌细胞因子共同参与机体的免疫调节，在自身免疫性疾病发病机制中起了重要作用[2]。因此寻找一种能够调节B淋巴细胞功能的药物，将有益于修复免疫，改善疾病进程。槐耳清膏是药用真菌槐耳菌质发酵后的热水提取物，目前已有成品槐耳颗粒是一种传统的抗肿瘤中药，在其抗肿瘤的机制研究中发现其同时具有免疫调节作用[3]。槐耳清膏对于B淋巴细胞是否具有调节作用从而达到治疗ITP疾病的目的，值得探究。

1 材料与方法

1.1 临床资料

分析大连医科大学附属第二医院诊断的20例ITP患者的外周血，中位年龄53.5（16.0～87.0）岁，其中男性8例，女性12例。患者血小板计数波动于1～28×109·L−1，所有患者诊断依据2020年中国原发免疫性血小板减少症（ITP）指南，除外继发血小板减少且均有治疗指征。患者主要临床特征，见表1。同时收集与患者的年龄及性别匹配的健康人作为对照，中位年龄49.5（23.0～82.0）岁。本研究取得本院伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。

表1 患者临床特征

1.2 方法

1.2.1 实验试剂 槐耳清膏（购于江苏盖天力药业公司），溶解于RPMI-1 640溶液（购于美国Gibco公司），应用0.22 μm 滤纸进行过滤，得到100 ng/mL的无菌溶液，−80℃冰箱储存。抗人CD40抗体购于美国BD公司。CpG寡聚脱氧核苷酸购于德国Miltenyi公司。抗人CD27-FITC抗体、抗人CD19-PE抗体、抗人CD24-APC抗体、抗人CD45-AmCyan和抗人CD38-PE-Cy7均购于美国eBioscience公司。

1.2.2 流式细胞术 EDTA抗凝血50 μL，根据试剂说明加入相应量流式相关抗体如下：抗人CD27-FITC抗体、抗人CD19-PE抗体、抗人CD24-APC抗体、抗人CD45-AmCyan，抗人CD38-PE-Cy7，室温避光孵育15 min，加入500 μL溶血素再次室温避光孵育15 min。1 800 r离心4 min，用PBS洗涤2次后上机测流式。培养的细胞收集后用PBS洗涤1次，加入上述抗体，室温避光孵育15 min，用PBS洗涤2次后上机测流式。

1.2.3 CCK-8 检测细胞增殖 在96 孔板每孔加入浓度为1×104·mL-1B细胞（HMy2.CIR细胞系，购自大连陈钰生物有限公司）悬液100 μL，加入不同浓度槐耳清膏处理细胞（2、4、6 mg），培养72 h，根据Cell Counting Kit-8(CCK-8，购于中国MCE公司)试剂说明，收集前向每实验孔加入10 μL CCK-8试剂，放入培养箱继续培养2 h，待其中培养基变色明显时检测。每孔设3个复孔，检测时用酶标仪检测450 nm处吸光度，用公式计算出相应的细胞活力, 应用GraphPad Prism 5计算IC50。

1.2.4 外周血单个核细胞制备及培养 EDTA抗凝患者外周血2 mL，按照操作指南，应用Ficoll-Hypaque密度梯度分离液，即淋巴细胞分离剂（购于天津TBD生物公司）提取单个核细胞，加入含10%胎牛血清RPMI-1 640培养基共孵育，加入10 kU·L−1青霉素及100 mg·L−1链霉素，加入CD40 3 μg·mL−1，CpG 2 μg·mL−1活化B细胞。后加或不加4 mg·L−1槐耳清膏，置于37℃，5%CO2孵箱中培养72 h，收集细胞测流式。

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism 5软件进行统计学分析。以t检验或单因素方法分析（one-way ANOVA）进行组间比较，数据以mean±SD表示。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ITP患者中B淋巴细胞比例高于健康对照组

比较20例ITP患者与健康对照组的外周血B细胞及其亚群是否有差异。应用流式细胞仪进行B细胞及其亚群分析，CD19+作为B细胞标记，CD19+CD27+作为记忆B细胞标记，CD19+CD24+CD38+作为调节B细胞标记，设门进行分析（图1A）。检测结果显示患者B细胞比例明显高于健康对照[（11.260±0.715) vs. (13.890±1.039）]（图1 B），差异具有统计学意义（P<0.05）；记忆B细胞比例在ITP中较健康对照比有升高趋势[（20.670±1.693) vs. (25.93±2.36）]，但差异无统计学意义（图1C）。而两组在调节B细胞比例上比较无显著性差异[（10.960±1.441) vs. (8.855±0.930）]（图1D）。

2.2 槐耳清膏抑制B淋巴细胞的增殖

应用人B淋巴细胞株，用不同浓度（2、4、6 mg·mL−1）槐耳清膏处理不同时间（24、48、72 h），CCK-8结果提示：槐耳清膏抑制B细胞增殖，且呈剂量依赖，与时间无相关关系，浓度为4 mg·mL−1时抑制率约为50%。因此在后续的实验中选用槐耳清膏4 mg·mL−1，见图2。

2.3 槐耳清膏对于B细胞亚群的变化

采用CD40、CpG活化PBMC中的B细胞，用槐耳清膏处理PBMC，流式细胞结果提示：槐耳清膏处理后无论是记忆B细胞还是调节B细胞，比例均明显下降。提示槐耳清膏可抑制记忆B（图3A）、调节B细胞（图3B）。差异均具有统计学差异（均P<0.05）。

3 讨论

ITP是一类获得性、免疫介导的、单独表现为血小板减少的疾病，外周血血小板计数<100×109·L-1，需要除外药物、感染、自身免疫性疾病、淋巴细胞增殖性疾病等其他继发因素。目前，认为ITP的发生是由于针对血小板膜糖蛋白-GpⅡbⅢa、GpⅠb产生抗体，从而导致血小板在肝脏及脾脏中被巨噬细胞吞噬过多，而骨髓不能代偿[4-5]，最终外周血血小板计数减少，引起出血倾向。其中B细胞被认为在发病机制中居于核心地位[6]。B细胞激活因子属于肿瘤坏死因子配体超家族的一种，是B细胞正常发育的主要刺激因子，在ITP患者血浆中水平升高，也间接证明了B细胞的主要作用[7]。基于此，一线治疗首先选择糖皮质激素，但长期有效率仅为50%，且66.67%患者最终会演变为慢性过程。长期应用糖皮质激素易带来不良反应，使很多患者生存质量下降。二线治疗包括CD20单克隆抗体、促血小板生成素及血小板受体激动剂，但价格昂贵，存在一定的不良反应，且难以维持或无法完全停药。脾脏切除长期有效率可以达到60%以上，但为有创治疗，而且有继发感染的风险[8]。所以仍然需要探索新的治疗。

中医中药是我国医学特色，已经有研究证明从中医体质角度进行调理ITP具有一定优势[9]。槐耳颗粒是一种传统中药，具有抗肿瘤作用[10-11]。在研究过程中发现其还具有免疫调节作用。同样含有槐耳菌丝的槐杞黄颗粒已经证明对于患儿ITP具有免疫调节作用[12]。那么，槐耳颗粒是否能够调节成人ITP患者B淋巴细胞增殖与分化，达到治疗疾病的目的，基于此，本课题组开展了此项研究。

本研究发现，ITP患者外周血中B淋巴细胞比例明显高于正常对照，与既往报道相一致[13]。这与B细胞是血小板抗体的主要产生者，而ITP患者体内血小板抗体增多有关[14]。CD20单克隆抗体能够清除B淋巴细胞，被用于ITP的治疗，证明了B细胞在ITP的发生中的重要作用[15]。本研究发现，槐耳清膏能够抑制ITP患者B细胞增殖，减少B淋巴细胞数量，类似去B细胞的作用。

记忆B细胞是B淋巴细胞亚群成分之一。文献报道记忆B细胞激活后转化为浆细胞，分泌抗体[16]，参与了免疫性疾病的发生。本研究发现，ITP患者记忆B淋巴细胞比例高于正常对照，但差异无统计学意义，这与Lyu等[17]报道相一致。经槐耳清膏共孵育后，ITP患者记忆B细胞增殖明显受抑。槐耳清膏抑制ITP患者记忆B细胞增殖，从而抑制了记忆B细胞向产生抗体的浆细胞过度转化，发挥了免疫调节作用。因此，这可能是槐耳清膏治疗ITP患者的潜在机制。

调节B细胞是B淋巴细胞亚群又一重要成分，通常认为其表达CD19+CD24+CD38+，在自身免疫疾病中发挥着重要的免疫抑制作用[18]。研究报道肾移植患者，调节B细胞增高是预测疾病预后良好的指标；相反，在系统性红斑狼疮患者中，由于调节B细胞分泌IL-10功能受损，导致疾病发生[18]。有研究证明，ITP患者调节B细胞比例下降，但治疗有效后可以明显增高[19]。但也有研究报道ITP患者调节B细胞高于正常对照，且高反应的B细胞与α干扰素水平呈正相关[20]。故调节B细胞在ITP中的作用尚未明确。分泌IL-10是调节B细胞发挥作用的重要部分，因此其功能损伤而并非数目多少对ITP疾病的发生更为重要。因此，亟需进一步研究槐耳清膏对于细胞因子IL-10水平的变化。

综上所述，本研究提示槐耳清膏体外可以抑制ITP患者B淋巴细胞的增殖，这为槐耳颗粒在ITP治疗中提供了理论依据。槐耳作为传统中药，成分稳定单一，深入探讨其免疫调节机制，将有助于槐耳颗粒在免疫相关疾病临床上的应用。