赵婧妍 李 兵

近年来，近视已经成为非常普遍的眼部疾病。高度近视不仅影响远视力，还会增加白内障及相关眼底病的风险[1]。近视主要是眼轴的异常延长，巩膜细胞外基质(ECM)发生重塑引起[2-3]。在巩膜重塑的过程中，转化生长因子-β1(TGF-β1)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶抑制剂-2(TIMP-2)和I型胶原蛋白(COL-I)十分重要[4]。过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs),是一类由配体激活的核转录因子Ⅱ型核激素受体超家族成员，包括PPARα、PPARβ、PPARy三种亚型。PPARy与其他核受体超家族要与相应的配体结合才能够活化[5]。活化的PPARy在多种器官中具有抗纤维化和抗血管生成作用，在抗纤维化中主要通过调控TGF-β1、COL-I、TIMP-2[6]和MMP-2[7]四种蛋白发挥作用。PPARy在眼部的研究中主要集中在角膜新生血管[8]、眼表瘢痕[9]和糖尿病性视网膜病变等方面，而在近视方面的研究较少，本研究旨在探讨PPARy受体激动剂对形觉剥夺性近视(FDM)的影响，以及对COL-I、TGF-β1、MMP-2和TIMP-2四种蛋白的作用，以期对近视的临床防治有一定的参考作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物普通级3周龄豚鼠40只(购于锦州医科大学实验动物中心)，雌雄不限，体重150～200 g，豚鼠屈光度+3.00～+6.00 D，双眼屈光参差≤+2.00 D，散光记为等效球镜度。实验前使用手持裂隙灯排除眼表异常、眼底病变的豚鼠。饲养条件：日光灯12 h/12 h昼夜规律，室温22～28 ℃，湿度50%，自由饮食，每天喂食充足新鲜大头菜以补充维生素C。实验中严格遵守动物3R原则与伦理要求。

1.1.2 主要试剂罗格列酮(上海源叶生物科技有限公司)，兔抗鼠TIMP-2单克隆抗体(NBP2-53347，美国NOVUS公司)，兔抗鼠TGF-β1多克隆抗体、兔抗鼠MMP-2多克隆抗体、兔抗鼠COL-I多克隆抗体、兔抗鼠GAPDH多克隆抗体(Proteintech中国公司)，通用SP试剂盒、DAB 显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，HE染色试剂盒(索莱宝生物科技有限公司)，检影验光仪(苏州六六视觉科技股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及方法40只豚鼠随机分成4组，实验眼均为右眼。正常组：不做处理；FDM组：戴头套，遮住右眼，露出左眼、双耳及口鼻；正常+罗格列酮组：每天上午进行一次腹腔注射罗格列酮5 mg·kg-1；FDM+罗格列酮组：戴头套，遮住右眼，露出左眼、双耳及口鼻，同时每天上午进行一次腹腔注射罗格列酮5 mg·kg-1。

1.2.2 眼部生物学参数测量在实验前和实验后28 d使用检影验光仪测量豚鼠屈光度，测量前，使用复方托吡卡胺滴眼液对实验眼进行散瞳，每5 min一次，共滴3次，再由同一位验光师进行屈光度检测，测量3次取平均值。实验后28 d，处死豚鼠后快速将眼球取出，剔除周围筋膜，置于冰上，使用游标卡尺测量眼轴长度，测量5次取平均值。

1.2.3 组织标本的处理每组取3只鼠眼置于FAS眼球固定液中固定24 h，脱水、石蜡包埋，每眼于巩膜后极部切片15张，每张切片厚度为5 μm，1张用于HE染色，1张用于阴性对照，其他用于免疫组织化学染色；取剩余7只鼠眼，沿角膜缘剪开，将眼前节组织、玻璃体及视网膜剔除，将巩膜组织于EP管中，-80 ℃冰箱保存，用于Western blot检测。

1.2.4 HE染色将石蜡切片置于60 ℃烤箱2 h，再经脱蜡水化、苏木素染色、分色、蓝化、伊红染色，脱水、透明，最后封片。观察巩膜厚度、胶原纤维排列整齐度。

1.2.5 免疫组织化学染色将石蜡切片于60 ℃烤片箱2 h，再脱水脱蜡、抗原修复、内源性过氧化物酶阻断、正常山羊血清封闭，一抗过夜(阴性对照组以PBS替代一抗)，滴加生物素标记山羊抗小鼠/兔IgG聚合物，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，DAB显色、冲洗、苏木素复染、返蓝、脱水、透明、封片。每种切片任意选取巩膜后极部进行图像采集,各获得9张图像，每种蛋白(COL-I、TGF-β1、MMP-2和TIMP-2蛋白)各随机选取5张图像，使用Image-pro plus 6.0 图像分析软件，测定各组蛋白的平均光密度。

1.2.6 Western blot检测取各组巩膜组织进行制样、电泳、转膜，10 g·L-1BSA于室温封闭2 h，一抗4 ℃冰箱过夜，二抗于室温孵育2 h，最后化学发光法(ECL)显影。使用ImageJ软件对所有条带进行蛋白(COL-I、TGF-β1、TIMP-2和MMP-2蛋白)灰度值测量，目的条带的灰度值除以内参灰度值得到相对表达量，再进行统计学分析。

1.3 统计学方法统计学分析采用 SPSS 25.0软件,计量指标用均数±标准差表示，多个组间的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验，检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 眼部生物学参数测量结果实验前，4组豚鼠屈光度均呈远视状态，差异无统计学意义(P>0.05)。实验后28 d，与正常组相比，FDM组豚鼠右眼屈光度和眼轴长度均增加，形成相对近视，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；正常+罗格列酮组豚鼠右眼屈光度与眼轴长度变化差异均无统计学意义(均为P>0.05)；FDM+罗格列酮组豚鼠右眼屈光度和眼轴长度变化差异均无统计学意义(均为P>0.05)。实验后28 d，与FDM组相比，FDM+罗格列酮组豚鼠右眼屈光度和眼轴长度均减少，差异均有统计学意义(均为P<0.05)(表1)。

表1 各组豚鼠屈光度、眼轴长度比较

2.2 HE染色形态学观察正常组：豚鼠巩膜纤维厚度正常，排列整齐、紧密，分布规则；FDM组：豚鼠巩膜纤维厚度明显变薄，排列紊乱、松散，断裂明显；正常+罗格列酮组：豚鼠巩膜纤维厚度正常，排列整齐、紧密，分布规则；FDM+罗格列酮组：豚鼠巩膜纤维厚度中等，排列稍有紊乱、松散(图1)。

图1 各组豚鼠巩膜HE染色结果(×400) 箭头示巩膜组织。

2.3 免疫组织化学染色结果COL-I蛋白在正常组、正常+罗格列酮组、FDM+罗格列酮组豚鼠巩膜均为高表达，呈棕色或棕黄色，在FDM组为低表达，差异有统计学意义(P<0.05)；TGF-β1蛋白在正常组、正常+罗格列酮组、FDM+罗格列酮组豚鼠巩膜中均为高表达，呈棕色或棕黄色，在FDM组为低表达，差异有统计学意义(P<0.05)；MMP-2在正常组、正常+罗格列酮组、FDM+罗格列酮组豚鼠巩膜中均为低表达，呈浅黄色，在FDM组为高表达，差异统计学意义(P<0.05)；TIMP-2蛋白在正常组、正常+罗格列酮组、FDM+罗格列酮组豚鼠巩膜中均为高表达，呈黄色，在FDM组为低表达，差异有统计学意义(P<0.05)(表2，图2)。

表2 免疫组织化学染色观察各组豚鼠巩膜中COL-I、TGF-β1、MMP-2和TIMP-2蛋白表达

图2 各组豚鼠免疫组织化学染色结果(×400) 1组为正常组，2组为FDM组，3组为正常+罗格列酮组，4组为FDM+罗格列酮组，5组为PBS阴性对照组。棕黄色、褐色为强阳性；黄色为阳性；浅黄色为弱阳性；未着色为阴性。箭头示巩膜组织。

2.4 Western blot检测各组豚鼠巩膜中蛋白的表达与正常组相比，FDM组豚鼠巩膜中COL-I、TGF-β1、TIMP-2蛋白的表达量均减少，MMP-2蛋白的表达量增加，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；正常+罗格列酮组豚鼠巩膜中COL-I和TGF-β1蛋白的表达量较正常组均增加，差异均有统计学意义(均为P<0.05)，TIMP-2和MMP-2蛋白的表达量差异均无统计学意义(P>0.05)；FDM+罗格列酮组豚鼠巩膜中COL-I蛋白的表达量与正常组接近，差异无统计学意义(P>0.05)，TGF-β1、TIMP-2蛋白表达量均增加，MMP-2蛋白表达量减小，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与FDM组相比，FDM+罗格列酮组豚鼠巩膜中COL-I、TGF-β1、TIMP-2蛋白的表达量均增加，MMP-2蛋白的表达量减少，差异均有统计学意义(均为P<0.05)(图3、表3)。

图3 各组豚鼠巩膜中COL-I、TGF-β1、TIMP-2和MMP-2蛋白的表达 1组为正常组，2组为FDM组，3组为正常+罗格列酮组，4组为FDM+罗格列酮组。

表3 各组豚鼠巩膜中COL-I、TGF-β1、TIMP-2和MMP-2蛋白的相对表达量

3 讨论

目前关于近视机制的研究，多数学者发现近视的调控与巩膜ECM的重塑有着一定的联系。在近视进程中，巩膜ECM重塑，同时眼轴拉长，巩膜变薄，胶原纤维排列紊乱、稀疏。在巩膜的ECM中，主要成分是胶原蛋白，其排列整齐致密，是维持眼球后极部形态的重要部分，其中COL-I蛋白的比例高达50%[10]。TGF-β1可以促进巩膜成纤维细胞分泌COL-I，而MMP-2是在ECM、胶原蛋白的降解过程中起主要作用的酶；同时TIMP-2是MMP-2的特异性抑制剂，在眼轴异常延长的过程中，MMP表达增加，ECM分解增加，巩膜厚度进一步变薄，因此，二者之间的平衡对近视眼的巩膜重塑起到重要作用[11-12]。以往的研究证实,在FDM小鼠眼中，MMP-2 mRNA和蛋白的表达均升高，TIMP-2蛋白的表达降低，TGF-β1蛋白的表达降低，COL-I蛋白的表达降低[13-14]，HIF-1α蛋白的表达升高[15]。

PPARy受体在抗纤维化的治疗过程中起到了重要作用，在纤维变形的过程中，存在大量的促炎因子的参与，其中TGF-β1是最重要的因子，起到了介导成纤维细胞的增殖与分化、促进ECM的合成以及减少ECM降解的作用[16]。以往的研究证明，罗格列酮激活PPARy能够抑制角膜、脉络膜新生血管形成，抑制生长因子诱导内皮细胞的增殖[8,17]。有临床研究报道，罗格列酮可延缓糖尿病性视网膜病变的进展[18]，还能抑制角膜、结膜组织的纤维化，包括角膜损伤、结膜瘢痕化等[19]。PPARy在损伤性疾病中具有神经保护作用，其激动剂对视神经也起到了保护作用[20]。有关PPARy在近视方面的研究较少，Pan等[21]发现PPARy拮抗剂对FDM没有影响，对正常豚鼠有近视漂移作用；而其激动剂GW1929能够抑制FDM的进展，对正常豚鼠没有影响；该研究还发现，PPARy受体激动剂通过下调缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)，而上调COL-I蛋白的表达水平，进而对豚鼠的屈光度起到调节作用。

PPARy必须与相对应的配体结合后才能够活化，其配体分为天然激动剂和合成激动剂，罗格列酮属于后者。罗格列酮在临床糖尿病以及眼部疾病的治疗中均有应用，安全性较高，本研究建立豚鼠FDM模型，探讨PPARy受体激动剂罗格列酮在豚鼠FDM的作用及其机制。与FDM组相比，FDM+罗格列酮组中，豚鼠屈光度与眼轴长度均减少(均为P<0.05)；巩膜纤维厚度中等，排列稍有紊乱、松散；Western blot检测结果显示，豚鼠巩膜中COL-I、TGF-β1、TIMP-2蛋白的表达量均增加，MMP-2蛋白的表达量减少(均为P<0.05)。本研究结果表明，罗格列酮通过增加FDM组豚鼠中COL-I、TGF-β1和TIMP-2蛋白的表达量，减少MMP-2蛋白的表达量，使得FDM组豚鼠的屈光度和眼轴长度的增长与延长都受到了抑制，提示PPARy受体激动剂罗格列酮对近视的进展起到了抑制作用。本研究还发现，在正常+罗格列酮组豚鼠中，COL-I、TGF-β1蛋白的表达量均上升，其中COL-I蛋白的表达量显著上升，通过Pan等[21]的研究结果发现PPARy受体激动剂GW1929能够减少HIF-1α的表达。综合分析，考虑原因可能是罗格列酮作为另一种激动剂，可能也会减少HIF-1α的表达，与增加TGF-β1蛋白共同作用，调节COL-I蛋白的表达，后续有机会可以尝试验证,结合屈光度和眼轴长度，提示罗格列酮对正常屈光度的豚鼠没有明显影响。本研究中罗格列酮能够抑制FDM的进展，且对正常豚鼠眼无影响，与其他研究一致[21]，通过本研究中四种蛋白与屈光度、眼轴长度等参数的变化情况，提示PPARy激动剂罗格列酮调控FDM的机制可能是：通过上调TGF-β1蛋白促进COL-I蛋白的分泌与合成，下调MMP-2蛋白的表达和上调其特异性抑制剂TIMP-2蛋白的表达，来减少COL-I蛋白的降解，进而达到调控巩膜重塑的目的，从而对FDM的形成起到了一定的抑制作用。通过蛋白变化的比较，考虑PPARy受体激动剂罗格列酮对FDM进展中该通路的作用和激动效果可能更为明显，也提示我们罗格列酮对FDM近视进展的抑制效果良好。本研究中豚鼠巩膜中COL-I、TGF-β1、MMP-2、TIMP-2四种蛋白表达的变化，与其他研究中有关肺[22]和肾[23]的抗纤维化过程中的变化并不一致，原因可能是抗纤维化与近视发生发展是两个不同的过程，二者受不同的机制调控。

本研究中豚鼠样本量较少，同时未做药物浓度梯度对比，后期可以考虑进行药物剂量梯度实验，以及尝试结膜下注射或滴眼等不同的给药方式，以期待探索出更加合适的给药剂量和给药方式。